登(deng)革熱(re)病毒III型(xing)PCR檢(jian)測(ce)試劑(ji)盒說明(ming)

【產品(pin)名(ming)稱(cheng)】

  通用(yong)名(ming)稱(cheng)：登(deng)革熱(re)病毒III型(xing)檢測(ce)試劑(ji)盒（實時(shi)熒(ying)光(guang)PCR法(fa)）

  英文名(ming)稱(cheng)：Dengue Fever virus  type III Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包(bao)裝(zhuang)規格(ge)】25T/盒 & 50T/盒

【預(yu)期(qi)用途(tu)】

登(deng)革熱(re)(Dengue Fever )是由登(deng)革熱(re)病毒引(yin)起的(de)壹(yi)種(zhong)急(ji)性發(fa)熱(re)性疾病，通常(chang)由在(zai)白(bai)天(tian)叮(ding)咬人的(de)埃(ai)及(ji)伊(yi)蚊和白紋(wen)伊(yi)蚊傳播(bo)，登(deng)革熱(re)病毒能(neng)夠(gou)引(yin)起壹(yi)系列(lie)臨床癥狀(zhuang)，包括有生命危險的(de)失(shi)血性休(xiu)克(ke)綜合征和較少(shao)見(jian)的(de)伴(ban)有肝(gan)衰與腦(nao)病的(de)急(ji)性肝(gan)炎。感染(ran)登(deng)革熱(re)病毒輕則突然(ran)發熱(re)、劇(ju)烈(lie)肌肉疼(teng)痛(tong)、骨(gu)關(guan)節(jie)痛(tong)，重(zhong)則(ze)廣泛(fan)出(chu)血(xue)、迅(xun)速休(xiu)克(ke)。

本試劑(ji)盒利(li)用實時(shi)熒(ying)光(guang)PCR原理(li)，定(ding)性檢(jian)測(ce)登(deng)革熱(re)病毒III型(xing)，對(dui)登(deng)革熱(re)病毒III型(xing)引(yin)起的(de)傳(chuan)染(ran)病及(ji)其(qi)並發(fa)癥的(de)診斷(duan)及(ji)療效(xiao)評估有重(zhong)要(yao)指導意(yi)義(yi)。

【檢驗(yan)原理(li)】

本試劑(ji)盒針(zhen)對(dui)登(deng)革熱(re)病毒III型(xing)基(ji)因組(zu)高(gao)度保守區(qu)域設計特異性引(yin)物(wu)和探(tan)針(zhen)，在(zai)反(fan)應體(ti)系(xi)中(zhong)含(han)登(deng)革熱(re)基(ji)因組(zu)模(mo)板(ban)的(de)情(qing)況(kuang)下，PCR反(fan)應得(de)以進(jin)行並釋(shi)放(fang)熒(ying)光(guang)信(xin)號。利(li)用儀器對(dui)PCR過程(cheng)中(zhong)相應(ying)通道(dao)的(de)信(xin)號強(qiang)度進(jin)行實(shi)時(shi)監測(ce)和(he)輸出(chu)，實(shi)現(xian)檢(jian)測(ce)結(jie)果(guo)的(de)定(ding)性分(fen)析(xi)。

【主要組(zu)成(cheng)成(cheng)份】

註(zhu)：陰(yin)性對(dui)照(zhao)為(wei)滅(mie)菌(jun)純(chun)水(shui)，陽(yang)性對(dui)照(zhao)為(wei)含(han)DFV-III靶基(ji)因的(de)質(zhi)粒(li)。

【儲存條件(jian)及(ji)有效(xiao)期(qi)】避(bi)光(guang)-20℃以下保(bao)存，避免(mian)反(fan)復(fu)凍融(rong),有效(xiao)期(qi)12個(ge)月。

【適(shi)用(yong)儀器(qi)】ABI 系列(lie)、Bio-Rad系(xi)列(lie)、Agilent Stratagene MX系(xi)列(lie) 、Roche LightCycler 480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列(lie)、杭州(zhou)博(bo)日系列(lie)等(deng)多(duo)通道(dao)實時(shi)熒(ying)光(guang)定(ding)量PCR儀(yi)。

【樣本要求】

1.登(deng)革熱(re)疑(yi)似病人，樣(yang)本采集方法(fa)如(ru)下：

（1）急(ji)性期(qi)患(huan)者（發病5日內(nei)）、恢復(fu)期(qi)患(huan)者和監(jian)測(ce)點(dian)發熱或(huo)病毒性腦(nao)炎病人的(de)血(xue)清(qing)，使(shi)用(yong)無(wu)菌(jun)註射(she)液(ye)抽(chou)取血清(qing)置(zhi)於離(li)心(xin)管中(zhong)待(dai)檢(jian)。

（2）患(huan)者（發病5日內(nei)）的(de)腦(nao)脊(ji)液(ye)使(shi)用無(wu)菌(jun)註射(she)液(ye)抽(chou)取置(zhi)於離(li)心(xin)管中(zhong)待(dai)檢(jian)。

2.監(jian)測(ce)點(dian)采集的(de)蚊蟲裝入(ru)50 ml無(wu)菌(jun)耐深低(di)溫的(de)外(wai)螺(luo)旋(xuan)離(li)心(xin)管中(zhong)待(dai)檢(jian)。

3.肌(ji)肉或(huo)內(nei)臟(zang)樣品(pin)：取少(shao)量樣品（2～3克(ke)）於研(yan)缽或(huo)勻漿(jiang)器中研(yan)磨將研(yan)磨勻漿轉入(ru)無(wu)菌(jun)離(li)心(xin)管中(zhong)，3000 rpm 離(li)心(xin)10分(fen)鐘取(qu)上清(qing)待(dai)檢(jian)。

4.應(ying)避免(mian)標本間(jian)交叉(cha)汙染(ran)。

5.樣(yang)本收集後(hou)可立(li)即(ji)檢測(ce)；若(ruo)不能立(li)即(ji)檢(jian)測(ce)，可(ke)置(zhi)於2～8℃冷(leng)藏過夜保(bao)存；如(ru)需長(chang)期(qi)保存，標本應凍(dong)存於-80℃以下，避(bi)免(mian)反(fan)復(fu)凍融(rong)，用(yong)幹(gan)冰(bing)或(huo)液(ye)氮運(yun)輸。

【檢(jian)驗(yan)方法(fa)】

1. 試劑(ji)準備(bei)（試劑(ji)準備(bei)區(qu)）

（1）從(cong)冰(bing)箱中(zhong)取(qu)出(chu)試劑(ji)盒, 從(cong)試劑(ji)盒中取(qu)出(chu)實(shi)驗(yan)所(suo)需試劑(ji),充(chong)分(fen)融(rong)化(hua)混(hun)勻(yun)並瞬(shun)時(shi)離(li)心(xin)以去(qu)除(chu)管壁(bi)附(fu)著(zhe)液(ye)體(ti)。

（2）核(he)算(suan)當(dang)次實(shi)驗(yan)所(suo)需要的(de)反(fan)應數(shu)（n），並根(gen)據如(ru)下表(biao)所(suo)示反(fan)應體(ti)系(xi)計(ji)算當(dang)次實(shi)驗(yan)所(suo)需要的(de)各(ge)種(zhong)試劑(ji)量(liang)。

n =陰(yin)性對(dui)照(zhao)數(shu)（1T）+陽性對(dui)照(zhao)數(shu)（1T）+誤(wu)差(cha)預(yu)留量（1T）+樣本數

（3）在(zai)無(wu)菌(jun)離(li)心(xin)管中(zhong)加入(ru)上述試劑(ji)，充(chong)分(fen)混(hun)勻(yun)後(hou)瞬(shun)時(shi)離(li)心(xin)。按照(zhao)20 μL/管分(fen)裝量(liang)將(jiang)試劑(ji)分(fen)裝至(zhi)PCR反(fan)應管。

2.樣本準備(bei)（樣本處(chu)理(li)區(qu)）

用DNA/RNA提取(qu)試劑(ji)盒提取(qu)核(he)酸(suan)即可(ke)，具(ju)體操(cao)作按照(zhao)其(qi)試劑(ji)盒說明(ming)書(shu)操(cao)作。

3.加樣

在(zai)上述制(zhi)備(bei)好的(de)PCR反(fan)應樣(yang)本管中(zhong)分(fen)別加入(ru)處(chu)理(li)好的(de)待(dai)測(ce)標本RNA各(ge)5 μl、終體積25 μl/管，蓋(gai)好(hao)PCR反(fan)應蓋(gai)混(hun)勻(yun)後(hou)瞬(shun)時(shi)低(di)速離(li)心(xin)，轉(zhuan)移(yi)到(dao)PCR儀器上。陰(yin)性對(dui)照(zhao)和(he)陽(yang)性對(dui)照(zhao)管則(ze)各(ge)加5 μL試劑(ji)盒自帶(dai)的(de)陰(yin)性對(dui)照(zhao)或(huo)陽性對(dui)照(zhao)品(pin)，終(zhong)體(ti)積為25 μl/管，蓋(gai)好(hao)PCR反(fan)應蓋(gai)混(hun)勻(yun)後(hou)瞬(shun)時(shi)低(di)速離(li)心(xin)，轉(zhuan)移(yi)到(dao)PCR儀器上。

（1）取(qu)樣(yang)本處(chu)理(li)區(qu)準備(bei)好的(de)PCR反(fan)應管，放(fang)置(zhi)在(zai)實(shi)時(shi)熒(ying)光(guang)定(ding)量PCR儀(yi)樣品槽相(xiang)應(ying)位置(zhi)，並記錄放(fang)置(zhi)順序。

（2）按下表(biao)設置(zhi)儀器核(he)酸擴(kuo)增(zeng)相(xiang)關參數(shu)進(jin)行PCR擴(kuo)增(zeng)。

註(zhu)：ABI系列(lie)熒(ying)光(guang)PCR儀(yi)在(zai)設置(zhi)時(shi)不選ROX校(xiao)正，設置(zhi)淬滅(mie)基(ji)團選擇None

【參考(kao)值（參考(kao)範圍）】

1.試劑(ji)盒有效(xiao)性判(pan)定(ding)：

（1）陽性對(dui)照(zhao)：有典(dian)型(xing)S型擴(kuo)增(zeng)曲(qu)線(xian)或(huo)Ct值≤35。

（2）陰(yin)性對(dui)照(zhao)：Ct值＞38或(huo)無(wu)Ct值，線形為(wei)直線(xian)或(huo)輕微斜(xie)線，無(wu)指數(shu)增(zeng)長(chang)期(qi)。

2.標本結(jie)果(guo)判(pan)定(ding)：

（1）陽性：標本檢測(ce)結(jie)果(guo)Ct值≤35或(huo)有明(ming)顯(xian)指數(shu)增(zeng)長(chang)期(qi)。

（2）可疑(yi)：標本檢測(ce)結(jie)果(guo)Ct值在(zai)35～38範圍內(nei)。此時(shi)應對(dui)標本進(jin)行重(zhong)復(fu)檢 測(ce)，如(ru)重復(fu)實驗(yan)結(jie)果(guo)Ct值仍在(zai)35～38範圍內(nei)，有明(ming)顯(xian)指數(shu)增(zeng)長(chang)期(qi)，則判(pan)定(ding)為陽(yang)性，否(fou)則(ze)為陰(yin)性。

（3）陰(yin)性：標本檢測(ce)結(jie)果(guo)Ct值＞38或(huo)無(wu)Ct值。

【檢(jian)驗(yan)結(jie)果(guo)的(de)解(jie)釋(shi)】

【檢驗(yan)方法(fa)的(de)局(ju)限性】

1. 當(dang)檢測(ce)樣(yang)本中被檢核(he)酸濃(nong)度低(di)於本試劑(ji)盒的(de)最(zui)di檢(jian)出(chu)限(xian)shi可(ke)能(neng)會(hui)發(fa)生假(jia)陰(yin)性的(de)結(jie)果(guo)。

2. 被檢樣(yang)本在(zai)采(cai)集(ji)、運輸、儲存以及(ji)處(chu)理(li)過程(cheng)中(zhong)操作方式不當(dang)容易(yi)造(zao)成RNA降解(jie)而(er)產(chan)生假(jia)陰(yin)性結(jie)果(guo)。

3. 樣(yang)本在(zai)采(cai)集(ji)、運輸、儲存以及(ji)處(chu)理(li)過程(cheng)中(zhong)發生交叉(cha)汙染(ran)，則(ze)容(rong)易(yi)得到假(jia)陽性結(jie)果(guo)。

【產品(pin)性能(neng)指(zhi)標】 產(chan)品的(de)最(zui)di檢(jian)出(chu)限(xian)為(wei)10³Copies/mL，產品(pin)CV值≤3%。

【註意(yi)事(shi)項(xiang)】

1. 使(shi)用(yong)本試劑(ji)盒的(de)實(shi)驗(yan)室(shi)，應嚴格(ge)按照(zhao)國(guo)家有關(guan)部分(fen)頒布(bu)的(de)有關(guan)基(ji)因擴(kuo)增(zeng)檢(jian)驗(yan)實(shi)驗(yan)室(shi)管理(li)規(gui)範進(jin)行管理(li)；

2. 為(wei)避(bi)免(mian)RNA降(jiang)解(jie)，樣(yang)本處(chu)理(li)過程(cheng)應(ying)在(zai)0-4℃條件(jian)下操(cao)作，且(qie)完(wan)成實驗(yan)後(hou)立即(ji)上機檢(jian)測(ce)；樣(yang)本處(chu)理(li)過程(cheng)中(zhong)使用(yong)的(de)器(qi)具(ju)耗(hao)材應經(jing)過無(wu)核酶(mei)處(chu)理(li)；

3. 各(ge)區(qu)域物(wu)品均(jun)為(wei)專用(yong)，不得交叉(cha)使用，以免(mian)汙染(ran)；檢測(ce)結(jie)束(shu)後(hou)，應立(li)即(ji)對(dui)工作臺(tai)清(qing)潔(jie)；

4. 吸(xi)取反(fan)應液(ye)時(shi)，應盡(jin)量避(bi)免(mian)產(chan)生氣(qi)泡；上 PCR 儀(yi)前(qian)，應(ying)註意(yi)檢(jian)查(zha)各(ge)反(fan)應管是(shi)否(fou)蓋緊，以免(mian)液(ye)體(ti)蒸發造(zao)成結(jie)果(guo)不準確(que)；

5. 試劑(ji)盒所(suo)有試劑(ji)在(zai)使(shi)用(yong)前應該在(zai)常(chang)溫下充(chong)分(fen)融(rong)化(hua)混(hun)勻(yun)，並應(ying)瞬(shun)時(shi)離(li)心(xin)；

6. 試劑(ji)盒內(nei)所(suo)配陰(yin)性和(he)陽(yang)性對(dui)照(zhao)在(zai)第(di)壹(yi)次(ci)使(shi)用前應全(quan)部轉(zhuan)移(yi)至(zhi)標本準備(bei)區(qu)，並單(dan)獨(du)存放(fang)；

7. 為(wei)防(fang)止(zhi)熒(ying)光(guang)幹(gan)擾，應避免(mian)裸(luo)手(shou)直接(jie)接(jie)觸(chu)PCR反(fan)應管，並應(ying)避免(mian)在(zai)PCR反(fan)應管上進(jin)行任(ren)何標記；

8. 檢(jian)測(ce)過程(cheng)中(zhong)使用(yong)過的(de)吸(xi)頭(tou)，應直接(jie)打(da)到(dao)盛有 10%次氯(lv)酸的(de)廢(fei)物(wu)缸內(nei)，檢(jian)測(ce)結(jie)束(shu)的(de)PCR 反(fan)應管，切(qie)忌(ji)開(kai)蓋，並與其(qi)他廢(fei)棄物(wu)品壹(yi)同(tong)滅(mie)菌(jun)後(hou)丟棄；工作臺(tai)及(ji)各(ge)種(zhong)實(shi)驗(yan)用(yong)品(pin)應(ying)定(ding)期(qi)用 10%次(ci)氯酸、75%酒(jiu)精或(huo)紫外(wai)燈進(jin)行消毒；

9. 儀(yi)器擴(kuo)增(zeng)相(xiang)關參數(shu)應按照(zhao)本說明(ming)書(shu)相(xiang)關(guan)要求進(jin)行設置(zhi)；不同(tong)批號試劑(ji)不能混(hun)用(yong)；並在(zai)有效(xiao)期(qi)內(nei)使(shi)用(yong)。