登(deng)革熱病(bing)毒IV型PCR檢(jian)測試(shi)劑盒(he)說(shuo)明(ming)書(shu)

【產品(pin)名(ming)稱】

  通(tong)用(yong)名(ming)稱：登革熱病(bing)毒IV型檢(jian)測試(shi)劑盒(he)（實(shi)時熒光(guang)PCR法）

  英文(wen)名(ming)稱：Dengue Fever virus  type IV Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝(zhuang)規格(ge)】25T/盒(he) & 50T/盒(he)

【預期用途(tu)】

登革熱(Dengue Fever )是由(you)登(deng)革熱病(bing)毒引(yin)起(qi)的(de)壹(yi)種(zhong)急(ji)性發熱性疾(ji)病(bing)，通(tong)常(chang)由(you)在(zai)白天叮咬(yao)人(ren)的(de)埃(ai)及(ji)伊(yi)蚊和白紋伊(yi)蚊傳播(bo)，登革熱病(bing)毒能(neng)夠(gou)引(yin)起(qi)壹系(xi)列(lie)臨床(chuang)癥(zheng)狀(zhuang)，包(bao)括(kuo)有生命(ming)危(wei)險(xian)的(de)失(shi)血(xue)性休克(ke)綜合(he)征(zheng)和較少(shao)見(jian)的(de)伴有肝(gan)衰與(yu)腦(nao)病(bing)的(de)急(ji)性肝(gan)炎。感(gan)染登革熱病(bing)毒輕則(ze)突然(ran)發熱、劇烈(lie)肌肉(rou)疼(teng)痛(tong)、骨關(guan)節(jie)痛，重(zhong)則廣(guang)泛(fan)出(chu)血(xue)、迅速(su)休克(ke)。

本(ben)試(shi)劑盒(he)利用實(shi)時熒光(guang)PCR原理(li)，定(ding)性檢(jian)測登革熱病(bing)毒IV型，對登革熱病(bing)毒IV型引(yin)起(qi)的(de)傳染(ran)病(bing)及其並發癥(zheng)的(de)診(zhen)斷(duan)及療效評(ping)估(gu)有重要指導(dao)意(yi)義。

【檢(jian)驗原(yuan)理(li)】

本(ben)試(shi)劑盒(he)針(zhen)對登革熱病(bing)毒IV型基因組(zu)高度(du)保(bao)守區(qu)域(yu)設計(ji)特異性引(yin)物(wu)和探針(zhen)，在反(fan)應(ying)體系中(zhong)含(han)登(deng)革熱基因組(zu)模板的(de)情(qing)況下(xia)，PCR反應(ying)得以進(jin)行並釋(shi)放熒光(guang)信(xin)號。利用儀(yi)器(qi)對PCR過程(cheng)中相應(ying)通(tong)道(dao)的(de)信(xin)號強(qiang)度(du)進(jin)行實(shi)時監(jian)測和輸(shu)出(chu)，實現檢(jian)測結果的(de)定(ding)性分(fen)析。

【主(zhu)要(yao)組(zu)成成份(fen)】

註：陰性對(dui)照為滅菌(jun)純水(shui)，陽性對(dui)照為含(han)DFV-III靶基因的(de)質(zhi)粒(li)。

【儲存條(tiao)件及有效期】避光(guang)-20℃以下(xia)保(bao)存，避免反(fan)復凍(dong)融(rong),有效期12個月(yue)。

【適用(yong)儀(yi)器(qi)】ABI 系列(lie)、Bio-Rad系列(lie)、Agilent Stratagene MX系列(lie) 、Roche LightCycler 480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列(lie)、杭州(zhou)博(bo)日(ri)系列(lie)等多(duo)通(tong)道(dao)實(shi)時熒光(guang)定(ding)量(liang)PCR儀。

【樣本(ben)要(yao)求】

1.登革熱疑似(si)病(bing)人，樣本(ben)采集方法如(ru)下(xia)：

（1）急性期患者（發病(bing)5日(ri)內(nei)）、恢復(fu)期患者和監(jian)測點發熱或病(bing)毒性腦(nao)炎病(bing)人的(de)血(xue)清，使(shi)用(yong)無菌(jun)註射(she)液抽(chou)取血(xue)清置於(yu)離心管中待(dai)檢(jian)。

（2）患者（發病(bing)5日(ri)內(nei)）的(de)腦(nao)脊液使(shi)用(yong)無菌(jun)註射(she)液抽(chou)取置(zhi)於(yu)離心管中待(dai)檢(jian)。

2.監(jian)測點采集的(de)蚊蟲(chong)裝(zhuang)入50 ml無菌(jun)耐深(shen)低(di)溫的(de)外(wai)螺(luo)旋(xuan)離心管中待(dai)檢(jian)。

3.肌肉(rou)或內(nei)臟樣(yang)品(pin)：取(qu)少(shao)量樣品(pin)（2～3克）於(yu)研(yan)缽(bo)或勻漿(jiang)器(qi)中研(yan)磨將(jiang)研(yan)磨勻漿(jiang)轉入無菌(jun)離心管中，3000 rpm 離心10分(fen)鐘取上清待(dai)檢(jian)。

4.應避(bi)免標本(ben)間(jian)交叉(cha)汙染。

5.樣本(ben)收(shou)集後可(ke)立即檢(jian)測；若(ruo)不(bu)能(neng)立(li)即檢(jian)測，可(ke)置於(yu)2～8℃冷(leng)藏過夜保存；如需長期保存，標本(ben)應(ying)凍存於(yu)-80℃以下(xia)，避(bi)免反(fan)復凍(dong)融(rong)，用(yong)幹(gan)冰(bing)或液氮運(yun)輸(shu)。

【檢(jian)驗方法】

1. 試劑準備(bei)（試(shi)劑準備(bei)區(qu)）

（1）從冰(bing)箱(xiang)中(zhong)取(qu)出(chu)試劑盒(he), 從試(shi)劑盒(he)中(zhong)取出(chu)實驗所(suo)需試(shi)劑,充(chong)分(fen)融(rong)化(hua)混(hun)勻並瞬(shun)時離心以去除(chu)管壁附(fu)著液(ye)體。

（2）核(he)算(suan)當次(ci)實(shi)驗(yan)所(suo)需要(yao)的(de)反(fan)應(ying)數(shu)（n），並根據如下(xia)表(biao)所示反應體系計(ji)算(suan)當次(ci)實(shi)驗(yan)所(suo)需要(yao)的(de)各種試(shi)劑量(liang)。

n =陰性對(dui)照數(shu)（1T）+陽性對(dui)照數(shu)（1T）+誤(wu)差(cha)預留(liu)量(liang)（1T）+樣本(ben)數(shu)

（3）在無(wu)菌(jun)離心管中加入上述試(shi)劑，充(chong)分(fen)混勻後(hou)瞬時離心。按(an)照(zhao)20 μL/管分(fen)裝(zhuang)量將(jiang)試(shi)劑分(fen)裝(zhuang)至PCR反應(ying)管。

2.樣本(ben)準備(bei)（樣(yang)本(ben)處理(li)區(qu)）

用DNA/RNA提(ti)取(qu)試(shi)劑盒(he)提(ti)取(qu)核(he)酸(suan)即可(ke)，具體操(cao)作(zuo)按照(zhao)其試(shi)劑盒(he)說(shuo)明(ming)書(shu)操(cao)作(zuo)。

3.加樣

在上述制(zhi)備(bei)好的(de)PCR反應(ying)樣(yang)本(ben)管中分(fen)別加入處理(li)好的(de)待(dai)測標本(ben)RNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋(gai)好PCR反應(ying)蓋(gai)混(hun)勻後(hou)瞬時低(di)速離心，轉(zhuan)移(yi)到PCR儀器(qi)上。陰性對(dui)照和陽性對(dui)照管則各加5 μL試劑盒(he)自(zi)帶(dai)的(de)陰(yin)性對(dui)照或陽性對(dui)照品(pin)，終(zhong)體積為25 μl/管，蓋(gai)好PCR反應(ying)蓋(gai)混(hun)勻後(hou)瞬時低(di)速離心，轉(zhuan)移(yi)到PCR儀器(qi)上。

（1）取樣(yang)本(ben)處理(li)區(qu)準備(bei)好的(de)PCR反應(ying)管，放置在(zai)實(shi)時熒光(guang)定(ding)量(liang)PCR儀樣(yang)品(pin)槽(cao)相應(ying)位(wei)置，並記(ji)錄放置順(shun)序(xu)。

（2）按下(xia)表(biao)設置(zhi)儀(yi)器(qi)核(he)酸(suan)擴增相關(guan)參(can)數(shu)進(jin)行PCR擴增(zeng)。

註：ABI系列(lie)熒光(guang)PCR儀在(zai)設置(zhi)時不(bu)選ROX校正(zheng)，設置(zhi)淬(cui)滅(mie)基團(tuan)選擇None

【參考(kao)值(zhi)（參考(kao)範圍）】

1.試劑盒(he)有效性判(pan)定(ding)：

（1）陽性對(dui)照：有典型S型擴(kuo)增(zeng)曲線或Ct值≤35。

（2）陰性對(dui)照：Ct值＞38或無Ct值，線(xian)形為直(zhi)線(xian)或輕微斜線(xian)，無指數(shu)增長期。

2.標本(ben)結果判(pan)定(ding)：

（1）陽性：標本(ben)檢(jian)測結果Ct值≤35或有明(ming)顯(xian)指(zhi)數(shu)增長期。

（2）可(ke)疑：標本(ben)檢(jian)測結果Ct值在(zai)35～38範圍內(nei)。此時應對(dui)標本(ben)進(jin)行重(zhong)復(fu)檢(jian) 測，如(ru)重(zhong)復(fu)實驗(yan)結果Ct值仍(reng)在(zai)35～38範圍內(nei)，有明(ming)顯(xian)指(zhi)數(shu)增長期，則判(pan)定(ding)為陽性，否(fou)則為陰(yin)性。

（3）陰性：標本(ben)檢(jian)測結果Ct值＞38或無Ct值。

【檢(jian)驗結果的(de)解(jie)釋(shi)】

【檢(jian)驗方法的(de)局限性】

1. 當檢(jian)測樣(yang)本(ben)中(zhong)被(bei)檢(jian)核(he)酸(suan)濃(nong)度(du)低(di)於(yu)本(ben)試(shi)劑盒(he)的(de)最(zui)di檢(jian)出(chu)限shi可(ke)能(neng)會(hui)發生假(jia)陰性的(de)結果。

2. 被(bei)檢(jian)樣本(ben)在(zai)采集、運(yun)輸(shu)、儲存以及(ji)處理(li)過程(cheng)中操(cao)作(zuo)方式(shi)不(bu)當容易造成RNA降解(jie)而(er)產生假(jia)陰性結果。

3. 樣本(ben)在(zai)采集、運(yun)輸(shu)、儲存以及(ji)處理(li)過程(cheng)中發生交(jiao)叉汙染，則(ze)容易得到假(jia)陽性結果。

【產品(pin)性能(neng)指(zhi)標】 產品(pin)的(de)最(zui)di檢(jian)出(chu)限為10³Copies/mL，產品(pin)CV值≤3%。

【註意(yi)事(shi)項(xiang)】

1. 使(shi)用(yong)本(ben)試(shi)劑盒(he)的(de)實(shi)驗(yan)室(shi)，應(ying)嚴(yan)格(ge)按照國(guo)家有關(guan)部(bu)分(fen)頒布的(de)有關(guan)基因擴(kuo)增檢(jian)驗實(shi)驗(yan)室(shi)管理規範進(jin)行管理；

2. 為避(bi)免RNA降解(jie)，樣本(ben)處理(li)過程(cheng)應在(zai)0-4℃條(tiao)件下(xia)操(cao)作(zuo)，且完(wan)成實驗(yan)後立即上機檢(jian)測；樣(yang)本(ben)處理(li)過程(cheng)中使(shi)用(yong)的(de)器(qi)具耗材(cai)應(ying)經(jing)過(guo)無核(he)酶處理(li)；

3. 各區(qu)域(yu)物(wu)品(pin)均(jun)為專用，不(bu)得交叉使(shi)用(yong)，以免汙染；檢(jian)測結束後，應立(li)即對(dui)工作(zuo)臺清潔；

4. 吸取反應(ying)液(ye)時，應盡(jin)量(liang)避免產生氣泡；上 PCR 儀前，應(ying)註意(yi)檢(jian)查各反應(ying)管是否(fou)蓋(gai)緊(jin)，以免液(ye)體蒸發造成結果不(bu)準確；

5. 試劑盒(he)所(suo)有試劑在(zai)使(shi)用(yong)前應(ying)該(gai)在(zai)常溫下(xia)充(chong)分(fen)融(rong)化(hua)混(hun)勻，並應(ying)瞬(shun)時離心；

6. 試劑盒(he)內(nei)所配(pei)陰(yin)性和陽性對(dui)照在(zai)第壹(yi)次(ci)使(shi)用(yong)前應(ying)全(quan)部(bu)轉(zhuan)移(yi)至標本(ben)準備(bei)區(qu)，並單(dan)獨(du)存放；

7. 為防(fang)止熒光(guang)幹擾(rao)，應(ying)避免裸(luo)手直接(jie)接(jie)觸(chu)PCR反應(ying)管，並應(ying)避(bi)免在(zai)PCR反應(ying)管上進(jin)行任何標記；

8. 檢(jian)測過(guo)程(cheng)中使(shi)用(yong)過的(de)吸頭，應直(zhi)接(jie)打(da)到盛(sheng)有 10%次(ci)氯酸的(de)廢(fei)物(wu)缸內(nei)，檢(jian)測結束的(de)PCR 反應(ying)管，切(qie)忌(ji)開蓋(gai)，並與(yu)其(qi)他(ta)廢(fei)棄物(wu)品(pin)壹(yi)同(tong)滅菌(jun)後丟棄；工作(zuo)臺及各種實(shi)驗(yan)用品(pin)應(ying)定(ding)期用 10%次(ci)氯酸、75%酒(jiu)精(jing)或紫外燈(deng)進(jin)行消(xiao)毒；

9. 儀器(qi)擴增相關(guan)參(can)數(shu)應按照本(ben)說(shuo)明(ming)書(shu)相關(guan)要(yao)求進(jin)行設置(zhi)；不(bu)同批(pi)號試劑不(bu)能(neng)混(hun)用；並在(zai)有效期內(nei)使(shi)用(yong)。