登(deng)革熱病毒(du)Ⅰ型(xing)PCR檢測(ce)試(shi)劑(ji)盒簡(jian)介(jie)

【產品名(ming)稱】

  通用(yong)名(ming)稱：登(deng)革熱病毒(du)Ⅰ型(xing)檢測(ce)試(shi)劑(ji)盒（實(shi)時熒光(guang)PCR法）

  英文名稱：Dengue Fever virus  typeⅠDetection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規格(ge)】25T/盒 & 50T/盒

【預(yu)期用(yong)途(tu)】

登(deng)革熱(Dengue Fever )是由登(deng)革熱病毒(du)引起(qi)的壹種(zhong)急(ji)性發熱性(xing)疾(ji)病，通常(chang)由(you)在白(bai)天(tian)叮(ding)咬(yao)人的(de)埃(ai)及(ji)伊蚊和白(bai)紋伊蚊傳(chuan)播，登(deng)革熱病毒(du)能(neng)夠引(yin)起(qi)壹系列(lie)臨床(chuang)癥(zheng)狀(zhuang)，包括有(you)生命(ming)危險(xian)的失血性(xing)休(xiu)克綜(zong)合征(zheng)和(he)較少(shao)見(jian)的(de)伴(ban)有(you)肝衰與(yu)腦病的急(ji)性(xing)肝炎。感(gan)染(ran)登(deng)革熱病毒(du)輕則(ze)突(tu)然(ran)發(fa)熱、劇(ju)烈(lie)肌(ji)肉疼(teng)痛(tong)、骨關節痛(tong)，重則(ze)廣(guang)泛(fan)出血、迅(xun)速休(xiu)克(ke)。

本試劑(ji)盒利(li)用(yong)實(shi)時熒光(guang)PCR原理，定(ding)性(xing)檢測(ce)登(deng)革熱病毒(du)，對登(deng)革熱病毒(du)引起(qi)的傳(chuan)染病及(ji)其並發癥的診斷及(ji)療(liao)效評(ping)估有(you)重要(yao)指(zhi)導(dao)意(yi)義。

【檢驗原理】

本試劑(ji)盒針對登(deng)革熱病毒(du)基因(yin)組高(gao)度保守(shou)區(qu)域設計特異(yi)性(xing)引(yin)物和探針，在反應(ying)體(ti)系中(zhong)含登(deng)革熱基因(yin)組模板(ban)的(de)情況(kuang)下(xia)，PCR反應(ying)得(de)以(yi)進行(xing)並釋(shi)放熒光(guang)信號。利用(yong)儀(yi)器(qi)對(dui)PCR過(guo)程中相應通道的(de)信號強度進行(xing)實(shi)時監測(ce)和(he)輸(shu)出，實(shi)現檢測(ce)結果的(de)定(ding)性(xing)分(fen)析。

【主要(yao)組成(cheng)成(cheng)份(fen)】

註：陰性對(dui)照(zhao)為滅菌(jun)純水(shui)，陽(yang)性對(dui)照為含DFV-Ⅰ靶基因(yin)的質(zhi)粒(li)。

【儲存條(tiao)件(jian)及(ji)有(you)效期】避(bi)光(guang)-20℃以(yi)下保(bao)存，避(bi)免(mian)反復(fu)凍(dong)融,有(you)效期12個(ge)月(yue)。

【適用(yong)儀(yi)器(qi)】ABI 系列(lie)、Bio-Rad系列(lie)、Agilent Stratagene MX系列(lie) 、Roche LightCycler 480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列(lie)、杭(hang)州博日(ri)系列(lie)等多通道實(shi)時熒光(guang)定(ding)量(liang)PCR儀。

【樣本要(yao)求(qiu)】

1.登(deng)革熱疑(yi)似(si)病人，樣本采集(ji)方(fang)法(fa)如(ru)下：

（1）急性期患者（發病5日(ri)內）、恢(hui)復期患者和監測(ce)點(dian)發(fa)熱或(huo)病毒(du)性腦炎(yan)病人的(de)血(xue)清(qing)，使(shi)用(yong)無(wu)菌(jun)註射(she)液抽(chou)取(qu)血(xue)清(qing)置於離(li)心(xin)管中待(dai)檢。

（2）患者（發病5日(ri)內）的(de)腦脊(ji)液使(shi)用(yong)無(wu)菌(jun)註射(she)液抽(chou)取(qu)置於離(li)心(xin)管中待(dai)檢。

2.監測(ce)點(dian)采集(ji)的(de)蚊(wen)蟲(chong)裝入50 ml無(wu)菌(jun)耐深低(di)溫(wen)的(de)外(wai)螺(luo)旋(xuan)離(li)心管中待(dai)檢。

3.肌肉或(huo)內臟(zang)樣品：取(qu)少(shao)量樣品（2～3克）於研(yan)缽(bo)或(huo)勻漿器中(zhong)研(yan)磨將研(yan)磨勻漿轉入無(wu)菌(jun)離心(xin)管中，3000 rpm 離心10分鐘取(qu)上(shang)清(qing)待(dai)檢。

4.應避(bi)免(mian)標本(ben)間(jian)交叉(cha)汙染(ran)。

5.樣本收(shou)集(ji)後(hou)可立即檢測(ce)；若(ruo)不能(neng)立即檢測(ce)，可置於2～8℃冷(leng)藏過(guo)夜保(bao)存(cun)；如(ru)需(xu)長期保存，標本(ben)應(ying)凍存於-80℃以(yi)下，避(bi)免(mian)反復(fu)凍(dong)融，用(yong)幹(gan)冰(bing)或(huo)液氮運(yun)輸(shu)。

【檢驗方法】

1. 試劑(ji)準備（試(shi)劑(ji)準備區(qu)）

（1）從冰箱中(zhong)取(qu)出(chu)試劑(ji)盒, 從試劑(ji)盒中(zhong)取(qu)出(chu)實驗(yan)所(suo)需(xu)試(shi)劑(ji),充(chong)分融化(hua)混勻並瞬時離(li)心以(yi)去(qu)除管壁(bi)附著(zhe)液體(ti)。

（2）核(he)算當(dang)次實驗(yan)所(suo)需(xu)要(yao)的(de)反應(ying)數(shu)（n），並根據如(ru)下表(biao)所示(shi)反應(ying)體(ti)系計(ji)算當(dang)次實驗(yan)所(suo)需(xu)要(yao)的(de)各(ge)種(zhong)試(shi)劑(ji)量。

n =陰性對照(zhao)數(shu)（1T）+陽(yang)性對(dui)照數(shu)（1T）+誤差預(yu)留(liu)量（1T）+樣本數(shu)

（3）在無(wu)菌(jun)離心(xin)管中加入上述(shu)試劑(ji)，充(chong)分混(hun)勻後(hou)瞬(shun)時離(li)心。按(an)照20 μL/管分裝量將試劑(ji)分裝至(zhi)PCR反應(ying)管。

2.樣本準備（樣本處(chu)理區）

用(yong)DNA/RNA提取(qu)試(shi)劑(ji)盒提取(qu)核(he)酸即可，具體(ti)操(cao)作按照(zhao)其試劑(ji)盒說(shuo)明書(shu)操(cao)作。

3.加樣

在上(shang)述(shu)制備好(hao)的(de)PCR反應(ying)樣本管中分(fen)別(bie)加入處(chu)理好(hao)的(de)待(dai)測(ce)標(biao)本RNA各(ge)5 μl、終體(ti)積25 μl/管，蓋好(hao)PCR反應(ying)蓋(gai)混勻後(hou)瞬(shun)時低(di)速離(li)心(xin)，轉移到PCR儀器上。陰(yin)性(xing)對照(zhao)和(he)陽(yang)性對(dui)照管則(ze)各(ge)加5 μL試劑(ji)盒自(zi)帶(dai)的(de)陰(yin)性對照(zhao)或(huo)陽(yang)性對(dui)照品，終(zhong)體(ti)積為25 μl/管，蓋好(hao)PCR反應(ying)蓋(gai)混勻後(hou)瞬(shun)時低(di)速離(li)心(xin)，轉移到PCR儀器上。

（1）取(qu)樣本處(chu)理區準備好(hao)的(de)PCR反應(ying)管，放置在實(shi)時熒光(guang)定(ding)量(liang)PCR儀樣品槽(cao)相(xiang)應(ying)位(wei)置，並記錄放置順(shun)序。

（2）按下表設置儀(yi)器(qi)核(he)酸擴增相(xiang)關(guan)參數(shu)進(jin)行(xing)PCR擴增。

註：ABI系列(lie)熒光(guang)PCR儀在設置時不(bu)選ROX校正(zheng)，設置淬(cui)滅(mie)基團選擇None

【參考值(zhi)（參(can)考範(fan)圍）】

1.試劑(ji)盒有(you)效性(xing)判定(ding)：

（1）陽(yang)性對(dui)照：有(you)典型(xing)S型(xing)擴增曲線(xian)或Ct值(zhi)≤35。

（2）陰性對照(zhao)：Ct值(zhi)＞38或無(wu)Ct值(zhi)，線(xian)形為直線(xian)或輕微斜線(xian)，無(wu)指(zhi)數(shu)增(zeng)長期。

2.標本結果判定(ding)：

（1）陽(yang)性：標(biao)本檢測(ce)結果Ct值(zhi)≤35或有(you)明顯(xian)指數(shu)增(zeng)長期。

（2）可疑：標本檢測(ce)結果Ct值(zhi)在35～38範(fan)圍內。此時應(ying)對標(biao)本進(jin)行重(zhong)復檢 測(ce)，如(ru)重復(fu)實驗結果Ct值(zhi)仍(reng)在35～38範(fan)圍內，有(you)明顯(xian)指數(shu)增(zeng)長期，則(ze)判定(ding)為陽(yang)性，否(fou)則(ze)為陰性。

（3）陰性：標本(ben)檢測(ce)結果Ct值(zhi)＞38或無(wu)Ct值(zhi)。

【檢驗結果的(de)解(jie)釋(shi)】

【檢驗方法的(de)局(ju)限(xian)性(xing)】

1. 當(dang)檢測(ce)樣本中(zhong)被檢核(he)酸濃(nong)度低(di)於本(ben)試(shi)劑(ji)盒的(de)最(zui)di檢出限(xian)shi可能(neng)會發(fa)生假陰性(xing)的(de)結果。

2. 被檢樣本在采集(ji)、運(yun)輸(shu)、儲存以(yi)及(ji)處(chu)理過(guo)程中操(cao)作方式(shi)不(bu)當(dang)容易造(zao)成(cheng)RNA降(jiang)解(jie)而產生假陰性(xing)結果。

3. 樣本在采集(ji)、運(yun)輸(shu)、儲存以(yi)及(ji)處(chu)理過(guo)程中發生交叉(cha)汙染(ran)，則(ze)容(rong)易得(de)到(dao)假陽(yang)性結果。

【產品性(xing)能(neng)指標(biao)】 產品的(de)最(zui)di檢出限(xian)為10³Copies/mL，產品CV值(zhi)≤3%。

【註意事項(xiang)】

1. 使(shi)用(yong)本(ben)試(shi)劑(ji)盒的(de)實(shi)驗(yan)室(shi)，應嚴格(ge)按(an)照(zhao)國家有(you)關部(bu)分(fen)頒(ban)布的有(you)關基因(yin)擴增檢驗實驗室(shi)管理規範(fan)進行(xing)管理；

2. 為避(bi)免(mian)RNA降(jiang)解(jie)，樣本處(chu)理過(guo)程應在0-4℃條件(jian)下操(cao)作，且完成(cheng)實(shi)驗後(hou)立即上機檢測(ce)；樣本處(chu)理過(guo)程中使(shi)用(yong)的(de)器(qi)具耗材應(ying)經(jing)過(guo)無(wu)核(he)酶(mei)處(chu)理；

3. 各(ge)區(qu)域(yu)物品均(jun)為專用(yong)，不(bu)得(de)交叉(cha)使(shi)用(yong)，以(yi)免(mian)汙染(ran)；檢測(ce)結束(shu)後(hou)，應(ying)立(li)即對工作臺(tai)清(qing)潔；

4. 吸取(qu)反應(ying)液時，應(ying)盡(jin)量避(bi)免(mian)產生氣(qi)泡(pao)；上 PCR 儀前，應(ying)註(zhu)意(yi)檢查各(ge)反應(ying)管是否(fou)蓋(gai)緊(jin)，以(yi)免(mian)液體(ti)蒸發造(zao)成結果不(bu)準確(que)；

5. 試劑(ji)盒所(suo)有(you)試劑(ji)在使(shi)用(yong)前應(ying)該(gai)在常(chang)溫(wen)下(xia)充(chong)分融化(hua)混勻，並應瞬時離(li)心；

6. 試劑(ji)盒內所(suo)配(pei)陰性和(he)陽(yang)性對(dui)照在第(di)壹次使(shi)用(yong)前應(ying)全部(bu)轉(zhuan)移至(zhi)標本(ben)準備區(qu)，並單(dan)獨存(cun)放；

7. 為防止熒光(guang)幹(gan)擾，應避(bi)免(mian)裸(luo)手直接接觸PCR反應(ying)管，並應避(bi)免(mian)在PCR反應(ying)管上進(jin)行任(ren)何(he)標記；

8. 檢測(ce)過(guo)程中使(shi)用(yong)過(guo)的吸(xi)頭，應(ying)直接打到(dao)盛有(you) 10%次氯酸的(de)廢物缸(gang)內，檢測(ce)結束(shu)的(de)PCR 反應(ying)管，切(qie)忌開蓋，並與其他(ta)廢棄物品壹同(tong)滅菌(jun)後丟棄(qi)；工作臺及(ji)各(ge)種(zhong)實(shi)驗用(yong)品應(ying)定(ding)期用(yong) 10%次氯酸、75%酒精或紫外(wai)燈(deng)進(jin)行消(xiao)毒(du)；

9. 儀器擴增相(xiang)關(guan)參數(shu)應(ying)按(an)照本說(shuo)明書(shu)相(xiang)關要(yao)求(qiu)進(jin)行(xing)設置；不同(tong)批(pi)號試劑(ji)不能(neng)混用(yong)；並在有(you)效期內使(shi)用(yong)。