登革熱病毒(du)（通用(yong)型）PCR檢測(ce)試(shi)劑(ji)盒簡介

【產品(pin)名稱】

  通用(yong)名稱：登(deng)革(ge)熱(re)病毒(du)（通用(yong)型）檢測(ce)試(shi)劑(ji)盒（實時熒光PCR法）

  英文名稱：Dengue Fever virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規格(ge)】25T/盒 & 50T/盒

【預(yu)期用(yong)途】

登革熱(Dengue Fever )是由(you)登革(ge)熱(re)病毒(du)引起的(de)壹(yi)種急性(xing)發(fa)熱(re)性(xing)疾病，通常由(you)在白(bai)天(tian)叮咬人的(de)埃及(ji)伊蚊(wen)和(he)白(bai)紋伊蚊(wen)傳播(bo)，登(deng)革熱(re)病毒(du)能夠(gou)引起壹(yi)系列(lie)臨(lin)床(chuang)癥(zheng)狀，包(bao)括有生命(ming)危(wei)險(xian)的(de)失血(xue)性(xing)休(xiu)克(ke)綜(zong)合(he)征和(he)較少(shao)見(jian)的(de)伴有肝衰(shuai)與(yu)腦(nao)病的(de)急性(xing)肝炎。感(gan)染登(deng)革(ge)熱病毒(du)輕(qing)則(ze)突(tu)然(ran)發(fa)熱(re)、劇(ju)烈肌肉(rou)疼痛(tong)、骨(gu)關(guan)節痛(tong)，重(zhong)則(ze)廣泛出血(xue)、迅(xun)速(su)休(xiu)克(ke)。

本試(shi)劑(ji)盒利用(yong)實時熒光PCR原(yuan)理，定性(xing)檢測登(deng)革熱(re)病毒(du)，對登革熱病毒(du)引起的(de)傳染病及其並發(fa)癥(zheng)的(de)診(zhen)斷(duan)及(ji)療效評估(gu)有重(zhong)要(yao)指(zhi)導(dao)意義。

【檢驗原(yuan)理】

本試(shi)劑(ji)盒針對登革熱病毒(du)基(ji)因組(zu)高(gao)度(du)保守區域設計(ji)特(te)異(yi)性(xing)引物和(he)探(tan)針，在反(fan)應(ying)體(ti)系中(zhong)含登(deng)革熱基(ji)因組(zu)模板(ban)的(de)情(qing)況下，PCR反應得以(yi)進(jin)行(xing)並(bing)釋(shi)放熒光信(xin)號。利用(yong)儀(yi)器對PCR過程(cheng)中(zhong)相應(ying)通道(dao)的(de)信(xin)號強(qiang)度(du)進(jin)行(xing)實時監(jian)測和(he)輸(shu)出，實現檢測結果的(de)定性(xing)分(fen)析。

【主要組(zu)成(cheng)成(cheng)份(fen)】

註：陰性(xing)對照為(wei)滅菌純水(shui)，陽(yang)性(xing)對照為(wei)含登革熱病毒(du)靶基(ji)因的(de)質粒。

【儲存條件及(ji)有效期】避光-20℃以(yi)下保(bao)存，避免反復凍(dong)融(rong),有效期12個月(yue)。

【適(shi)用(yong)儀(yi)器】ABI 系列(lie)、Bio-Rad系列(lie)、Agilent Stratagene MX系列(lie) 、Roche LightCycler 480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列(lie)、杭(hang)州(zhou)博(bo)日系列(lie)等多(duo)通道(dao)實時熒光定量PCR儀(yi)。

【樣(yang)本要(yao)求】

1.登革熱疑(yi)似(si)病人，樣(yang)本采(cai)集方法如(ru)下(xia)：

（1）急性(xing)期患(huan)者（發(fa)病5日內(nei)）、恢復期(qi)患(huan)者和(he)監(jian)測點發(fa)熱(re)或病毒(du)性(xing)腦(nao)炎病人的(de)血(xue)清，使用(yong)無菌(jun)註射(she)液(ye)抽(chou)取血(xue)清置(zhi)於(yu)離(li)心(xin)管中(zhong)待檢(jian)。

（2）患(huan)者（發(fa)病5日內(nei)）的(de)腦(nao)脊液(ye)使(shi)用(yong)無菌(jun)註射(she)液(ye)抽(chou)取置(zhi)於(yu)離(li)心(xin)管中(zhong)待檢(jian)。

2.監(jian)測點采(cai)集的(de)蚊(wen)蟲(chong)裝入50 ml無菌耐深低溫(wen)的(de)外(wai)螺旋離(li)心(xin)管中(zhong)待檢(jian)。

3.肌肉(rou)或內(nei)臟樣(yang)品(pin)：取少(shao)量(liang)樣(yang)品(pin)（2～3克(ke)）於(yu)研缽或勻漿器中(zhong)研磨(mo)將研磨(mo)勻漿轉入無(wu)菌離(li)心(xin)管中(zhong)，3000 rpm 離(li)心(xin)10分(fen)鐘(zhong)取上(shang)清待檢(jian)。

4.應避免標本(ben)間(jian)交叉汙染。

5.樣(yang)本收集後(hou)可(ke)立(li)即(ji)檢測(ce)；若(ruo)不(bu)能立(li)即(ji)檢測(ce)，可(ke)置(zhi)於(yu)2～8℃冷藏(zang)過夜(ye)保(bao)存；如(ru)需長期保(bao)存(cun)，標本(ben)應凍(dong)存(cun)於(yu)-80℃以(yi)下，避免反復凍(dong)融(rong)，用(yong)幹冰(bing)或(huo)液(ye)氮運輸(shu)。

【檢驗方法】

1. 試(shi)劑(ji)準(zhun)備（試(shi)劑(ji)準(zhun)備區）

（1）從冰(bing)箱中(zhong)取出試(shi)劑(ji)盒, 從試(shi)劑(ji)盒中(zhong)取出實驗所(suo)需試(shi)劑(ji),充分(fen)融(rong)化(hua)混(hun)勻(yun)並(bing)瞬時離(li)心(xin)以(yi)去(qu)除(chu)管(guan)壁附著(zhe)液(ye)體(ti)。

（2）核算當次(ci)實驗所(suo)需要的(de)反應(ying)數（n），並根據如(ru)下(xia)表(biao)所(suo)示反(fan)應(ying)體(ti)系計(ji)算當次(ci)實驗所(suo)需要的(de)各種(zhong)試(shi)劑(ji)量(liang)。

n =陰性(xing)對照數(shu)（1T）+陽(yang)性(xing)對照數(shu)（1T）+誤(wu)差預(yu)留量（1T）+樣(yang)本數(shu)

（3）在無(wu)菌(jun)離(li)心(xin)管中(zhong)加(jia)入(ru)上(shang)述(shu)試(shi)劑(ji)，充(chong)分(fen)混勻後(hou)瞬時離(li)心(xin)。按(an)照20 μL/管分(fen)裝量將(jiang)試(shi)劑(ji)分(fen)裝至PCR反應管。

2.樣(yang)本準(zhun)備（樣(yang)本處(chu)理區）

用(yong)DNA/RNA提取試(shi)劑(ji)盒提取核酸即(ji)可，具(ju)體(ti)操作按(an)照其(qi)試(shi)劑(ji)盒說明書(shu)操作。

3.加(jia)樣(yang)

在上(shang)述(shu)制(zhi)備好(hao)的(de)PCR反應樣(yang)本管(guan)中(zhong)分(fen)別(bie)加(jia)入(ru)處(chu)理好(hao)的(de)待測(ce)標本(ben)RNA各5 μl、終體(ti)積(ji)25 μl/管，蓋好(hao)PCR反應蓋混(hun)勻後(hou)瞬時低速(su)離(li)心(xin)，轉移(yi)到PCR儀(yi)器上(shang)。陰(yin)性(xing)對照和(he)陽(yang)性(xing)對照管(guan)則(ze)各加(jia)5 μL試(shi)劑(ji)盒自帶(dai)的(de)陰性(xing)對照或(huo)陽(yang)性(xing)對照品(pin)，終體(ti)積(ji)為(wei)25 μl/管，蓋好(hao)PCR反應蓋混(hun)勻後(hou)瞬時低速(su)離(li)心(xin)，轉移(yi)到PCR儀(yi)器上(shang)。

（1）取樣(yang)本處(chu)理區準(zhun)備好(hao)的(de)PCR反應管，放置(zhi)在實時熒光定量PCR儀(yi)樣(yang)品(pin)槽相應(ying)位置(zhi)，並(bing)記(ji)錄(lu)放置(zhi)順(shun)序(xu)。

（2）按(an)下(xia)表(biao)設置(zhi)儀(yi)器核(he)酸(suan)擴增相(xiang)關(guan)參(can)數進(jin)行(xing)PCR擴增。

註：ABI系列(lie)熒光PCR儀(yi)在設(she)置(zhi)時(shi)不(bu)選(xuan)ROX校正，設(she)置(zhi)淬(cui)滅基(ji)團(tuan)選擇(ze)None

【參(can)考(kao)值（參(can)考(kao)範(fan)圍）】

1.試(shi)劑(ji)盒有效性(xing)判(pan)定(ding)：

（1）陽(yang)性(xing)對照：有典(dian)型S型擴增曲(qu)線(xian)或Ct值≤35。

（2）陰性(xing)對照：Ct值＞38或無Ct值，線(xian)形為(wei)直(zhi)線(xian)或輕(qing)微(wei)斜線(xian)，無指(zhi)數增長(chang)期(qi)。

2.標本(ben)結果(guo)判(pan)定(ding)：

（1）陽(yang)性(xing)：標本(ben)檢測(ce)結果(guo)Ct值≤35或有明顯指(zhi)數(shu)增長(chang)期(qi)。

（2）可疑(yi)：標本(ben)檢測(ce)結果(guo)Ct值在35～38範(fan)圍內(nei)。此(ci)時(shi)應對標本(ben)進(jin)行(xing)重(zhong)復檢(jian) 測(ce)，如(ru)重(zhong)復實驗結(jie)果(guo)Ct值仍(reng)在35～38範(fan)圍內(nei)，有明顯指(zhi)數(shu)增長(chang)期(qi)，則(ze)判(pan)定(ding)為陽(yang)性(xing)，否則(ze)為陰性(xing)。

（3）陰性(xing)：標本(ben)檢測(ce)結果(guo)Ct值＞38或無Ct值。

【檢驗結果(guo)的(de)解釋(shi)】

【檢驗方法的(de)局限(xian)性(xing)】

1. 當檢(jian)測樣(yang)本中(zhong)被(bei)檢(jian)核(he)酸(suan)濃(nong)度(du)低於本(ben)試(shi)劑(ji)盒的(de)最(zui)di檢(jian)出限(xian)shi可(ke)能(neng)會發(fa)生假(jia)陰性(xing)的(de)結果(guo)。

2. 被(bei)檢(jian)樣(yang)本在采(cai)集、運輸(shu)、儲存(cun)以(yi)及處(chu)理過程(cheng)中(zhong)操作方式(shi)不當容(rong)易(yi)造(zao)成(cheng)RNA降(jiang)解而(er)產生假(jia)陰性(xing)結果。

3. 樣(yang)本在采(cai)集、運輸(shu)、儲存(cun)以(yi)及處(chu)理過程(cheng)中(zhong)發(fa)生交(jiao)叉汙染，則(ze)容(rong)易(yi)得到假(jia)陽(yang)性(xing)結果。

【產品(pin)性(xing)能指標】 產品(pin)的(de)最(zui)di檢(jian)出限(xian)為(wei)10³ Copies/mL，產品(pin)CV值≤3%。

【註意事(shi)項(xiang)】

1. 使用(yong)本試(shi)劑(ji)盒的(de)實驗室(shi)，應(ying)嚴格按(an)照國家(jia)有關(guan)部(bu)分(fen)頒(ban)布(bu)的(de)有關(guan)基(ji)因擴增檢(jian)驗(yan)實驗室(shi)管(guan)理規範(fan)進(jin)行(xing)管(guan)理；

2. 為避免RNA降(jiang)解，樣(yang)本處(chu)理過程(cheng)應(ying)在0-4℃條件下(xia)操(cao)作，且完成(cheng)實驗後(hou)立(li)即(ji)上(shang)機(ji)檢(jian)測；樣(yang)本處(chu)理過程(cheng)中(zhong)使用(yong)的(de)器具(ju)耗材應經過無(wu)核(he)酶(mei)處(chu)理；

3. 各區域物品(pin)均為(wei)專用(yong)，不得交叉(cha)使用(yong)，以(yi)免汙染；檢測結束後(hou)，應(ying)立(li)即(ji)對工作臺(tai)清潔；

4. 吸取反應液(ye)時(shi)，應盡量(liang)避免產生氣泡；上(shang) PCR 儀(yi)前(qian)，應(ying)註(zhu)意檢查(zha)各(ge)反應(ying)管(guan)是否蓋緊，以(yi)免液(ye)體(ti)蒸發(fa)造(zao)成(cheng)結果(guo)不(bu)準(zhun)確；

5. 試(shi)劑(ji)盒所有試(shi)劑(ji)在使(shi)用(yong)前(qian)應(ying)該(gai)在常溫(wen)下充分(fen)融(rong)化(hua)混(hun)勻(yun)，並(bing)應瞬時離(li)心(xin)；

6. 試(shi)劑(ji)盒內(nei)所(suo)配(pei)陰性(xing)和(he)陽(yang)性(xing)對照在第壹(yi)次(ci)使(shi)用(yong)前(qian)應(ying)全(quan)部轉移(yi)至標本(ben)準(zhun)備區，並單獨(du)存放；

7. 為防止熒光幹擾，應避免裸(luo)手(shou)直(zhi)接(jie)接(jie)觸(chu)PCR反應管，並(bing)應避免在PCR反應管上(shang)進(jin)行(xing)任(ren)何(he)標記(ji)；

8. 檢測過程(cheng)中(zhong)使用(yong)過的(de)吸頭(tou)，應(ying)直(zhi)接(jie)打(da)到盛(sheng)有 10%次(ci)氯(lv)酸(suan)的(de)廢物(wu)缸(gang)內(nei)，檢(jian)測(ce)結束的(de)PCR 反應管，切(qie)忌(ji)開蓋(gai)，並(bing)與(yu)其他(ta)廢棄(qi)物(wu)品(pin)壹(yi)同滅菌後(hou)丟(diu)棄；工作臺(tai)及各種(zhong)實驗用(yong)品(pin)應定(ding)期(qi)用(yong) 10%次(ci)氯(lv)酸(suan)、75%酒(jiu)精(jing)或紫(zi)外(wai)燈進(jin)行(xing)消毒(du)；

9. 儀(yi)器擴增相(xiang)關(guan)參(can)數應(ying)按(an)照本(ben)說(shuo)明書(shu)相關(guan)要(yao)求進(jin)行(xing)設(she)置(zhi)；不同批號(hao)試(shi)劑(ji)不(bu)能混用(yong)；並在有效期內(nei)使(shi)用(yong)。