登革(ge)熱病毒II型PCR檢(jian)測試(shi)劑(ji)盒(he)操(cao)作(zuo)步驟

【產(chan)品(pin)名(ming)稱(cheng)】

  通(tong)用名(ming)稱(cheng)：登(deng)革(ge)熱病毒II型檢(jian)測試(shi)劑(ji)盒(he)（實(shi)時熒(ying)光(guang)PCR法(fa)）

  英(ying)文(wen)名(ming)稱(cheng)：Dengue Fever virus  type II Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝(zhuang)規格】25T/盒(he) & 50T/盒(he)

【預期(qi)用途】

登(deng)革(ge)熱(Dengue Fever )是(shi)由(you)登(deng)革熱病毒引(yin)起(qi)的壹(yi)種(zhong)急性(xing)發熱性(xing)疾病，通(tong)常(chang)由在白(bai)天(tian)叮咬(yao)人(ren)的(de)埃(ai)及伊蚊和(he)白(bai)紋(wen)伊蚊傳播，登革(ge)熱病毒能(neng)夠(gou)引(yin)起(qi)壹(yi)系(xi)列臨床癥(zheng)狀，包括(kuo)有(you)生(sheng)命危(wei)險的失(shi)血性(xing)休克綜合征和(he)較少(shao)見的(de)伴有(you)肝衰與腦病的急性(xing)肝炎(yan)。感染(ran)登革熱病毒輕(qing)則(ze)突然(ran)發熱、劇烈肌(ji)肉疼(teng)痛(tong)、骨關(guan)節痛(tong)，重則(ze)廣泛(fan)出(chu)血、迅(xun)速(su)休(xiu)克。

本(ben)試(shi)劑(ji)盒(he)利(li)用實(shi)時熒(ying)光(guang)PCR原(yuan)理(li)，定(ding)性(xing)檢(jian)測登革熱病毒II型，對(dui)登(deng)革(ge)熱病毒II型引(yin)起(qi)的傳(chuan)染病及其(qi)並(bing)發癥(zheng)的診斷及療效評(ping)估(gu)有(you)重要指導意義。

【檢(jian)驗(yan)原(yuan)理(li)】

本(ben)試(shi)劑(ji)盒(he)針(zhen)對登(deng)革熱病毒II型基因組(zu)高(gao)度(du)保守區域設計特(te)異性(xing)引(yin)物(wu)和(he)探針(zhen)，在反(fan)應體系(xi)中(zhong)含登(deng)革(ge)熱基因組(zu)模板(ban)的(de)情況下(xia)，PCR反(fan)應得(de)以(yi)進行並釋(shi)放(fang)熒(ying)光(guang)信(xin)號。利用儀(yi)器對PCR過(guo)程(cheng)中(zhong)相(xiang)應通(tong)道的(de)信(xin)號強度(du)進行實(shi)時監(jian)測和(he)輸出(chu)，實(shi)現(xian)檢(jian)測結(jie)果(guo)的(de)定(ding)性(xing)分析。

【主(zhu)要(yao)組(zu)成(cheng)成份】

註(zhu)：陰(yin)性(xing)對照(zhao)為滅(mie)菌(jun)純(chun)水(shui)，陽(yang)性(xing)對照(zhao)為含DFV-II靶(ba)基因的(de)質(zhi)粒。

【儲(chu)存(cun)條件及有(you)效期(qi)】避(bi)光(guang)-20℃以(yi)下(xia)保(bao)存(cun)，避免反復凍(dong)融,有(you)效期(qi)12個(ge)月(yue)。

【適(shi)用儀(yi)器】ABI 系(xi)列、Bio-Rad系(xi)列、Agilent Stratagene MX系(xi)列 、Roche LightCycler 480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系(xi)列、杭州(zhou)博日(ri)系(xi)列等多通(tong)道實(shi)時熒(ying)光(guang)定(ding)量(liang)PCR儀(yi)。

【樣本(ben)要求(qiu)】

1.登(deng)革(ge)熱疑(yi)似病人，樣本(ben)采集(ji)方(fang)法(fa)如(ru)下(xia)：

（1）急性(xing)期(qi)患(huan)者(zhe)（發病5日(ri)內）、恢(hui)復期(qi)患(huan)者(zhe)和(he)監(jian)測點(dian)發(fa)熱或病毒性(xing)腦炎病人的(de)血清(qing)，使(shi)用無菌(jun)註射(she)液抽(chou)取血清(qing)置於(yu)離心(xin)管(guan)中待檢(jian)。

（2）患(huan)者(zhe)（發病5日(ri)內）的(de)腦脊液(ye)使用無菌(jun)註射(she)液抽(chou)取置於(yu)離心(xin)管(guan)中待檢(jian)。

2.監(jian)測點(dian)采集(ji)的(de)蚊蟲(chong)裝(zhuang)入(ru)50 ml無菌(jun)耐深(shen)低溫的外螺旋(xuan)離心(xin)管(guan)中待檢(jian)。

3.肌(ji)肉或內臟樣品(pin)：取少(shao)量(liang)樣品(pin)（2～3克）於研(yan)缽或勻漿器中研(yan)磨將(jiang)研(yan)磨勻漿轉(zhuan)入無菌(jun)離心(xin)管(guan)中，3000 rpm 離心(xin)10分鐘(zhong)取上清(qing)待檢(jian)。

4.應避免(mian)標本(ben)間交(jiao)叉汙(wu)染。

5.樣本(ben)收集(ji)後(hou)可(ke)立(li)即檢(jian)測；若不(bu)能(neng)立(li)即檢(jian)測，可置於(yu)2～8℃冷(leng)藏過夜保存(cun)；如需長(chang)期(qi)保(bao)存(cun)，標本(ben)應凍(dong)存(cun)於-80℃以(yi)下(xia)，避(bi)免反復凍(dong)融(rong)，用幹冰或液氮運輸。

【檢(jian)驗(yan)方(fang)法(fa)】

1. 試(shi)劑(ji)準(zhun)備（試(shi)劑(ji)準(zhun)備區）

（1）從(cong)冰(bing)箱(xiang)中取出(chu)試(shi)劑(ji)盒(he), 從(cong)試(shi)劑(ji)盒(he)中(zhong)取出(chu)實(shi)驗所需試(shi)劑(ji),充(chong)分融化(hua)混勻(yun)並(bing)瞬時離心(xin)以(yi)去除(chu)管(guan)壁附著液體。

（2）核(he)算(suan)當次(ci)實(shi)驗所需要(yao)的(de)反應數（n），並(bing)根(gen)據(ju)如下(xia)表(biao)所示反應體系(xi)計算(suan)當次(ci)實(shi)驗所需要(yao)的(de)各種(zhong)試(shi)劑(ji)量。

n =陰(yin)性(xing)對照(zhao)數（1T）+陽(yang)性(xing)對照(zhao)數（1T）+誤(wu)差預留量（1T）+樣本(ben)數

（3）在(zai)無菌(jun)離心(xin)管(guan)中加入(ru)上述試(shi)劑(ji)，充(chong)分混勻(yun)後(hou)瞬時離心(xin)。按照(zhao)20 μL/管(guan)分裝(zhuang)量(liang)將(jiang)試(shi)劑(ji)分裝(zhuang)至(zhi)PCR反(fan)應管。

2.樣本(ben)準(zhun)備（樣本(ben)處(chu)理(li)區）

用DNA/RNA提取試(shi)劑(ji)盒(he)提取核(he)酸(suan)即可，具(ju)體操(cao)作(zuo)按照(zhao)其試(shi)劑(ji)盒(he)說明(ming)書操(cao)作(zuo)。

3.加樣

在(zai)上述制(zhi)備好的PCR反(fan)應樣本(ben)管中(zhong)分別加入(ru)處(chu)理(li)好的待測標本(ben)RNA各(ge)5 μl、終(zhong)體積(ji)25 μl/管(guan)，蓋(gai)好PCR反(fan)應蓋(gai)混(hun)勻(yun)後(hou)瞬時低速(su)離心(xin)，轉(zhuan)移到(dao)PCR儀(yi)器上。陰(yin)性(xing)對照(zhao)和(he)陽(yang)性(xing)對照(zhao)管則(ze)各加5 μL試(shi)劑(ji)盒(he)自(zi)帶(dai)的(de)陰(yin)性(xing)對照(zhao)或陽性(xing)對照(zhao)品，終(zhong)體積(ji)為(wei)25 μl/管(guan)，蓋(gai)好PCR反(fan)應蓋(gai)混(hun)勻(yun)後(hou)瞬時低速(su)離心(xin)，轉(zhuan)移到(dao)PCR儀(yi)器上。

（1）取樣本(ben)處(chu)理(li)區準(zhun)備好的PCR反(fan)應管，放(fang)置在(zai)實(shi)時熒(ying)光(guang)定(ding)量(liang)PCR儀(yi)樣品(pin)槽(cao)相(xiang)應位(wei)置，並(bing)記錄(lu)放(fang)置順(shun)序。

（2）按下(xia)表(biao)設置儀(yi)器核(he)酸(suan)擴增相(xiang)關(guan)參(can)數進行PCR擴增。

註(zhu)：ABI系(xi)列熒光(guang)PCR儀(yi)在(zai)設置時不(bu)選ROX校(xiao)正，設置淬(cui)滅(mie)基團(tuan)選擇(ze)None

【參(can)考值（參(can)考範(fan)圍(wei)）】

1.試(shi)劑(ji)盒(he)有(you)效性(xing)判定(ding)：

（1）陽(yang)性(xing)對照(zhao)：有(you)典(dian)型S型擴增曲(qu)線(xian)或Ct值(zhi)≤35。

（2）陰(yin)性(xing)對照(zhao)：Ct值(zhi)＞38或無Ct值(zhi)，線(xian)形(xing)為直(zhi)線(xian)或輕(qing)微斜(xie)線(xian)，無指數增長(chang)期(qi)。

2.標本(ben)結(jie)果(guo)判定(ding)：

（1）陽(yang)性(xing)：標本(ben)檢(jian)測結(jie)果(guo)Ct值(zhi)≤35或有(you)明(ming)顯指數增長(chang)期(qi)。

（2）可(ke)疑(yi)：標本(ben)檢(jian)測結(jie)果(guo)Ct值(zhi)在(zai)35～38範(fan)圍(wei)內(nei)。此時應對標本(ben)進行重復(fu)檢(jian) 測，如重復(fu)實(shi)驗結(jie)果(guo)Ct值(zhi)仍(reng)在(zai)35～38範(fan)圍(wei)內(nei)，有(you)明(ming)顯指數增長(chang)期(qi)，則(ze)判定(ding)為(wei)陽(yang)性(xing)，否則(ze)為陰(yin)性(xing)。

（3）陰(yin)性(xing)：標本(ben)檢(jian)測結(jie)果(guo)Ct值(zhi)＞38或無Ct值(zhi)。

【檢(jian)驗(yan)結(jie)果(guo)的(de)解(jie)釋(shi)】

【檢(jian)驗(yan)方(fang)法(fa)的局(ju)限性(xing)】

1. 當檢(jian)測樣本(ben)中被(bei)檢(jian)核(he)酸(suan)濃度低於本(ben)試(shi)劑(ji)盒(he)的(de)最(zui)d檢(jian)出(chu)限shi可(ke)能(neng)會(hui)發生(sheng)假(jia)陰(yin)性(xing)的結(jie)果(guo)。

2. 被(bei)檢(jian)樣本(ben)在采集(ji)、運(yun)輸、儲存(cun)以(yi)及(ji)處(chu)理(li)過(guo)程(cheng)中操作(zuo)方式(shi)不當容易造成(cheng)RNA降(jiang)解而(er)產生(sheng)假(jia)陰(yin)性(xing)結(jie)果(guo)。

3. 樣本(ben)在采集(ji)、運(yun)輸、儲存(cun)以(yi)及(ji)處(chu)理(li)過(guo)程(cheng)中發生(sheng)交叉(cha)汙(wu)染，則(ze)容易得(de)到(dao)假(jia)陽(yang)性(xing)結(jie)果(guo)。

【產(chan)品(pin)性(xing)能(neng)指標】 產(chan)品(pin)的(de)最di檢(jian)出(chu)限為(wei)10³Copies/mL，產(chan)品(pin)CV值(zhi)≤3%。

【註(zhu)意(yi)事(shi)項(xiang)】

1. 使(shi)用本試(shi)劑(ji)盒(he)的(de)實(shi)驗室，應嚴(yan)格按照(zhao)國(guo)家有(you)關部(bu)分頒布(bu)的有(you)關基因擴增檢(jian)驗(yan)實(shi)驗室管理規範(fan)進行管理(li)；

2. 為(wei)避(bi)免(mian)RNA降(jiang)解，樣本(ben)處(chu)理(li)過(guo)程(cheng)應在0-4℃條(tiao)件(jian)下(xia)操(cao)作(zuo)，且(qie)完(wan)成(cheng)實(shi)驗後(hou)立(li)即上機(ji)檢(jian)測；樣本(ben)處(chu)理(li)過(guo)程(cheng)中使用的器具耗材(cai)應經(jing)過無核(he)酶(mei)處(chu)理(li)；

3. 各(ge)區域物(wu)品(pin)均(jun)為(wei)專(zhuan)用，不得(de)交(jiao)叉使用，以(yi)免(mian)汙(wu)染；檢(jian)測結(jie)束後(hou)，應立(li)即對工作(zuo)臺(tai)清(qing)潔(jie)；

4. 吸(xi)取反應液時，應盡量(liang)避免(mian)產(chan)生(sheng)氣泡(pao)；上 PCR 儀(yi)前(qian)，應註意(yi)檢(jian)查各反應管是(shi)否蓋(gai)緊(jin)，以(yi)免(mian)液體蒸(zheng)發(fa)造成(cheng)結(jie)果(guo)不(bu)準(zhun)確；

5. 試(shi)劑(ji)盒(he)所(suo)有(you)試(shi)劑(ji)在使(shi)用前應該在(zai)常溫下(xia)充(chong)分融化(hua)混勻(yun)，並(bing)應瞬時離心(xin)；

6. 試(shi)劑(ji)盒(he)內(nei)所(suo)配陰(yin)性(xing)和(he)陽(yang)性(xing)對照(zhao)在第(di)壹(yi)次(ci)使用前應全(quan)部(bu)轉(zhuan)移至標本(ben)準(zhun)備區，並單(dan)獨存(cun)放(fang)；

7. 為(wei)防(fang)止熒(ying)光(guang)幹擾(rao)，應避免(mian)裸(luo)手(shou)直(zhi)接(jie)接(jie)觸(chu)PCR反(fan)應管，並(bing)應避免(mian)在PCR反(fan)應管上進行任何標記；

8. 檢(jian)測過程中(zhong)使(shi)用過的吸(xi)頭，應直(zhi)接(jie)打到(dao)盛有(you) 10%次(ci)氯酸(suan)的廢物(wu)缸內，檢(jian)測結(jie)束的PCR 反(fan)應管，切(qie)忌開(kai)蓋(gai)，並(bing)與(yu)其(qi)他廢棄物(wu)品(pin)壹(yi)同滅(mie)菌(jun)後(hou)丟棄；工作(zuo)臺(tai)及各種(zhong)實(shi)驗用品應定(ding)期(qi)用 10%次(ci)氯酸(suan)、75%酒(jiu)精或紫外燈進行消毒；

9. 儀(yi)器擴增相(xiang)關(guan)參(can)數應按照(zhao)本說明(ming)書相(xiang)關(guan)要(yao)求進行設置；不(bu)同(tong)批(pi)號試(shi)劑(ji)不能(neng)混用；並(bing)在(zai)有(you)效期(qi)內(nei)使用。