馬(ma)鼻(bi)疽(ju)桿菌PCR檢測(ce)試劑盒(he)簡介(jie)

【產品名稱(cheng)】

通(tong)用名稱(cheng)：馬(ma)鼻(bi)疽(ju)桿菌檢(jian)測(ce)試劑盒(he)（實(shi)時熒光PCR法(fa)）

英(ying)文名稱(cheng)：Malleomyces mallei Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包(bao)裝規格】 25T/盒(he) & 50T/盒(he)

【預期(qi)用(yong)途】

本試劑盒(he)利用實(shi)時熒光PCR原理，定性(xing)檢測(ce)馬(ma)鼻(bi)疽(ju)桿菌，對(dui)馬(ma)鼻(bi)疽(ju)桿菌的(de)診斷(duan)和(he)監控(kong)具(ju)有重要(yao)指導意(yi)義。

【檢(jian)驗(yan)原理】

本試劑盒(he)針對馬(ma)鼻(bi)疽(ju)桿菌基(ji)因設(she)計特異(yi)性引(yin)物和(he)分子(zi)信標探(tan)針，在(zai)待檢樣本中(zhong)含有馬(ma)鼻(bi)疽(ju)桿菌DNA的(de)情況下，PCR反(fan)應(ying)得以(yi)進行(xing)並(bing)釋放熒光信號(hao)。利用(yong)儀(yi)器(qi)對(dui)PCR過(guo)程(cheng)中(zhong)相應(ying)熒光信號(hao)進行(xing)實(shi)時監(jian)測(ce)和(he)輸出，實(shi)現(xian)檢測(ce)結(jie)果的(de)定性(xing)分析(xi)。

【主(zhu)要(yao)組成成(cheng)份】

註(zhu)：陰性對(dui)照為(wei)滅(mie)菌純水，陽(yang)性對照為含馬(ma)鼻(bi)疽(ju)桿菌靶(ba)基(ji)因的(de)質粒(li)。

【儲(chu)存條(tiao)件及有效期】避光-20℃以(yi)下保(bao)存，避免反(fan)復(fu)凍融(rong)，有效期12個(ge)月(yue)。

【適用(yong)儀(yi)器(qi)】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler 480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭(hang)州(zhou)博日(ri)系列等(deng)多通道實(shi)時熒光定量(liang)PCR儀(yi)。

【樣本要(yao)求(qiu)】

1.血(xue)液(ye)或血清(qing)樣品：使(shi)用(yong)無菌註射液(ye)抽取(qu)樣品置(zhi)於離(li)心管中(zhong)待檢。

2.標本采集管應(ying)包含含有蛋(dan)白穩(wen)定劑的(de)病毒運輸液(ye)。

3.應(ying)避免標本間交叉(cha)汙(wu)染(ran)。

4.標本收(shou)集後可立即檢(jian)測(ce)；若不(bu)能立(li)即檢(jian)測(ce)，可置(zhi)於2～8℃冷藏過夜(ye)保(bao)存；如(ru)需(xu)長期保(bao)存，標本應(ying)凍存於-80℃以(yi)下，避免反(fan)復(fu)凍融(rong)。

【檢(jian)驗(yan)方法(fa)】

1. 試(shi)劑準(zhun)備(bei)（試(shi)劑準(zhun)備(bei)區）

（1）從(cong)冰箱中(zhong)取(qu)出試(shi)劑盒(he), 從(cong)試劑盒(he)中(zhong)取(qu)出實(shi)驗(yan)所(suo)需(xu)試(shi)劑，充(chong)分融(rong)化(hua)混(hun)勻並(bing)瞬(shun)時離(li)心以(yi)去除管壁(bi)附著(zhe)液(ye)體。

（2）核(he)算當次(ci)實(shi)驗(yan)所(suo)需(xu)要(yao)的(de)反(fan)應(ying)數（n），並(bing)根據如(ru)下表(biao)所(suo)示(shi)反(fan)應(ying)體系計算當次(ci)實(shi)驗(yan)所(suo)需(xu)要(yao)的(de)各種(zhong)試劑量(liang)。

n =陰(yin)性對照(zhao)數（1T）+陽(yang)性對照數（1T）+誤差預留量(liang)（1T）+樣本數

（3）在(zai)無菌離心管中(zhong)加(jia)入上述試劑，充(chong)分混(hun)勻後瞬(shun)時離(li)心。按(an)照20μL/管分裝(zhuang)量(liang)將試(shi)劑分(fen)裝至PCR反(fan)應(ying)管。

（4）蓋(gai)緊(jin)PCR反(fan)應(ying)管蓋(gai)後將PCR反(fan)應(ying)管轉(zhuan)移(yi)至(zhi)樣本處理區。剩余(yu)試劑放回-20℃以(yi)下冰箱冷凍保(bao)存。

2.樣本準備(bei)（樣本處理區）

用(yong)DNA/RNA提(ti)取(qu)試劑盒(he)提取(qu)核(he)酸(suan)即可(ke)，具(ju)體操作(zuo)按(an)照其(qi)試(shi)劑盒(he)說(shuo)明書操

3.加(jia)樣

在(zai)上述制備(bei)好(hao)的(de)PCR反(fan)應(ying)樣本管中(zhong)分(fen)別加入處(chu)理好(hao)的(de)待測(ce)標本DNA各(ge)5 μl、終(zhong)體積(ji)25 μl/管，蓋(gai)好(hao)PCR反(fan)應(ying)蓋(gai)混(hun)勻後瞬(shun)時低(di)速(su)離(li)心，轉(zhuan)移(yi)到(dao)PCR儀(yi)器(qi)上。陰性(xing)對照(zhao)和(he)陽(yang)性對照管則各加(jia)5 μL試(shi)劑盒(he)自帶(dai)的(de)陰性(xing)對照(zhao)或陽(yang)性對照品，終(zhong)體積(ji)為25 μl/管，蓋(gai)好(hao)PCR反(fan)應(ying)蓋(gai)混(hun)勻後瞬(shun)時低(di)速(su)離(li)心，轉(zhuan)移(yi)到(dao)PCR儀(yi)器(qi)上。

4.PCR（PCR擴(kuo)增(zeng)區）

（1）取(qu)樣本處理區準備(bei)好(hao)的(de)PCR反(fan)應(ying)管，放置(zhi)在(zai)實(shi)時熒光定量(liang)PCR儀(yi)樣品槽(cao)相應(ying)位(wei)置(zhi)，並記錄放置(zhi)順(shun)序。

（2）按(an)下表(biao)設(she)置(zhi)儀器(qi)核(he)酸(suan)擴(kuo)增(zeng)相關參(can)數進行(xing)PCR擴(kuo)增(zeng)。

註(zhu)：ABI系列熒光PCR儀(yi)在(zai)設(she)置(zhi)時不(bu)選ROX校(xiao)正(zheng)，設(she)置(zhi)淬(cui)滅(mie)基(ji)團(tuan)選擇None。

【參(can)考值（參(can)考範圍(wei)）】

1.試(shi)劑盒(he)有效性判(pan)定：

（1）陽(yang)性對照：有典(dian)型S型擴(kuo)增(zeng)曲線或(huo)Ct值≤35。

（2）陰(yin)性對照(zhao)：Ct值＞38或(huo)無Ct值，線形(xing)為(wei)直線或(huo)輕微斜線，無指數增(zeng)長期。

2.標本結(jie)果判(pan)定：

（1）陽(yang)性：標本檢測(ce)結(jie)果Ct值≤35或(huo)有明顯(xian)指數增(zeng)長期。

（2）可(ke)疑：標本檢測(ce)結(jie)果Ct值在(zai)35～38範圍(wei)內。此時應(ying)對標本進行(xing)重復(fu)檢(jian)測(ce)，如(ru)重復(fu)實(shi)驗(yan)結(jie)果Ct值仍在(zai)35～38範圍(wei)內，有明顯(xian)指數增(zeng)長期，則判(pan)定為(wei)陽(yang)性，否則為陰(yin)性(xing)。

（3）陰(yin)性：標本檢測(ce)結(jie)果Ct值＞38或(huo)無Ct值。

【檢(jian)驗(yan)結(jie)果的(de)解(jie)釋】

【檢(jian)驗(yan)方法(fa)的(de)局(ju)限(xian)性】

1. 當檢測(ce)樣本中(zhong)被(bei)檢核(he)酸(suan)濃度低(di)於本試劑盒(he)的(de)最(zui)di檢(jian)出限(xian)shi可(ke)能會發(fa)生假(jia)陰(yin)性的(de)結(jie)果。

2. 被(bei)檢樣本在(zai)采集(ji)、運輸、儲(chu)存以及處(chu)理過(guo)程(cheng)中(zhong)操作(zuo)方(fang)式(shi)不(bu)當容易(yi)造(zao)成(cheng)DNA降(jiang)解(jie)而(er)產生假(jia)陰(yin)性結(jie)果。

3. 樣本在(zai)采集(ji)、運輸、儲(chu)存以及處(chu)理過(guo)程(cheng)中(zhong)發(fa)生交叉(cha)汙(wu)染(ran)，則容易(yi)得到(dao)假(jia)陽(yang)性結(jie)果。

【產品性(xing)能(neng)指標】 產品的(de)最(zui)di檢(jian)出限(xian)為10³ Copies/mL，產品CV值≤3%。

【註(zhu)意(yi)事項(xiang)】

1. 使(shi)用本試劑盒(he)的(de)實(shi)驗(yan)室(shi)，應(ying)嚴格按(an)照國家有關部分頒布的(de)有關基(ji)因擴(kuo)增(zeng)檢驗(yan)實(shi)驗(yan)室(shi)管理規(gui)範進行(xing)管理；

2. 為(wei)避免RNA降(jiang)解(jie)，樣本處理過(guo)程(cheng)應(ying)在(zai)0-4℃條(tiao)件下操作(zuo)，且(qie)完(wan)成(cheng)實(shi)驗(yan)後立即上機檢測(ce)；樣本處理過(guo)程(cheng)中(zhong)使(shi)用的(de)器(qi)具(ju)耗(hao)材應(ying)經過(guo)無核(he)酶處理；

3. 各(ge)區域(yu)物(wu)品均(jun)為(wei)專(zhuan)用(yong)，不(bu)得交(jiao)叉(cha)使用(yong)，以免汙(wu)染(ran)；檢(jian)測(ce)結(jie)束(shu)後，應(ying)立即(ji)對工(gong)作臺清(qing)潔；

4. 吸(xi)取(qu)反(fan)應(ying)液(ye)時，應(ying)盡量(liang)避免產生氣泡(pao)；上 PCR 儀(yi)前(qian)，應(ying)註意(yi)檢查(zha)各(ge)反(fan)應(ying)管是(shi)否蓋(gai)緊(jin)，以(yi)免液(ye)體蒸發造成結(jie)果不(bu)準確(que)；

5. 試(shi)劑盒(he)所(suo)有試(shi)劑在(zai)使用(yong)前(qian)應(ying)該(gai)在(zai)常(chang)溫(wen)下充分(fen)融(rong)化(hua)混(hun)勻，並(bing)應(ying)瞬(shun)時離(li)心；

6. 試(shi)劑盒(he)內所(suo)配(pei)陰(yin)性(xing)和(he)陽(yang)性對照在(zai)第壹(yi)次(ci)使用(yong)前(qian)應(ying)全部轉(zhuan)移(yi)至(zhi)標本準備(bei)區，並單(dan)獨存放；

7. 為(wei)防止(zhi)熒光幹擾，應(ying)避免裸(luo)手直接(jie)接(jie)觸(chu)PCR反(fan)應(ying)管，並應(ying)避免在(zai)PCR反(fan)應(ying)管上進行(xing)任(ren)何標記；

8. 檢(jian)測(ce)過程(cheng)中(zhong)使(shi)用過的(de)吸頭，應(ying)直接(jie)打到(dao)盛有 10%次(ci)氯(lv)酸的(de)廢物(wu)缸內，檢測(ce)結(jie)束(shu)的(de)PCR 反(fan)應(ying)管，切(qie)忌(ji)開(kai)蓋(gai)，並(bing)與(yu)其(qi)他(ta)廢(fei)棄物品壹(yi)同(tong)滅(mie)菌後丟棄；工(gong)作臺及各(ge)種實(shi)驗(yan)用品應(ying)定期(qi)用 10%次(ci)氯(lv)酸、75%酒精(jing)或紫(zi)外燈(deng)進行(xing)消(xiao)毒；

9. 儀(yi)器(qi)擴(kuo)增(zeng)相關參(can)數應(ying)按(an)照本說(shuo)明書相關要(yao)求(qiu)進行(xing)設(she)置(zhi)；不(bu)同(tong)批(pi)號(hao)試劑不(bu)能混(hun)用；並(bing)在(zai)有效期內使用(yong)。