藍舌病病(bing)毒(du)​PCR檢(jian)測試(shi)劑(ji)盒簡(jian)介

【產(chan)品(pin)名(ming)稱】

通(tong)用名(ming)稱：藍舌病病(bing)毒(du)檢(jian)測試(shi)劑(ji)盒（實(shi)時(shi)熒(ying)光(guang)PCR法）

英文名(ming)稱：Bluetongue Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包(bao)裝規(gui)格】 25T/盒(he) & 50T/盒(he)

【預(yu)期用途(tu)】

本試(shi)劑(ji)盒利(li)用實(shi)時(shi)熒(ying)光(guang)PCR原(yuan)理(li)，定性(xing)檢(jian)測藍舌病病(bing)毒(du)，對藍舌病病(bing)毒(du)引(yin)起的(de)疾病診斷(duan)及療效(xiao)評(ping)估(gu)有(you)重要指(zhi)導意(yi)義(yi)。

【檢(jian)驗原(yuan)理(li)】

本試(shi)劑(ji)盒針對藍舌病病(bing)毒(du)的(de)高(gao)度(du)保(bao)守區(qu)域設(she)計(ji)特(te)異性(xing)引(yin)物和探針，在(zai)反(fan)應體系中含藍舌病病(bing)毒(du)基(ji)因(yin)組模板(ban)的(de)情況下，PCR反(fan)應得以(yi)進行(xing)並(bing)釋(shi)放(fang)熒(ying)光(guang)信(xin)號。利(li)用熒(ying)光(guang)定量(liang)PCR儀(yi)對PCR過(guo)程中相應通道(dao)信(xin)號進行(xing)實(shi)時(shi)監(jian)測和輸出，實(shi)現(xian)檢測結果的(de)定性(xing)分析(xi)。

【主(zhu)要組成(cheng)成(cheng)份(fen)】

註(zhu)：陰性(xing)對照(zhao)為(wei)滅(mie)菌純水(shui)，陽(yang)性(xing)對照(zhao)為(wei)含(han)藍舌病靶基(ji)因(yin)的(de)質(zhi)粒(li)。

【儲(chu)存條(tiao)件及有效(xiao)期】避(bi)光-20℃以(yi)下保存，避(bi)免反(fan)復(fu)凍(dong)融(rong)，有(you)效期12個(ge)月(yue)。

【適(shi)用儀(yi)器(qi)】ABI 系(xi)列、Bio-Rad系(xi)列、Agilent Stratagene MX系(xi)列、Roche LightCycler 480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系(xi)列、杭(hang)州(zhou)博(bo)日(ri)系列等多(duo)通(tong)道(dao)實時(shi)熒(ying)光(guang)定量(liang)PCR儀(yi)。

【樣(yang)本要求】

1. 適(shi)用標本類型(xing)：發病(bing)動(dong)物(wu)血液(ye)、空(kong)腸及小腸腸內(nei)容(rong)物(wu)及組織(zhi)臟器(qi)(腸道(dao)組織(zhi)、腸系膜(mo)及淋巴結等)和病毒(du)培(pei)養(yang)液(ye)。

2. 標本采集，方法如下：

(1) 血清(qing)：用壹次性(xing)註(zhu)射器(qi)取(qu)靜(jing)脈(mai)血2-3ml，轉(zhuan)至(zhi)5ml 的(de)幹燥(zao)管(guan)中，密閉送檢。

(2) 腸內(nei)容(rong)物(wu)：無菌條(tiao)件下取(qu)腸道(dao)內(nei)容(rong)物(wu)約(yue)1g 左(zuo)右，置入(ru)1ml 含(han)有1.0ml PBS(或(huo)生(sheng)理(li)鹽水(shui))的(de)5ml 離心(xin)管(guan)中，立(li)即送檢。

(3) 組織(zhi)臟器(qi)：取(qu)發病(bing)動(dong)物(wu)腸道(dao)組織(zhi)及腸系膜(mo)淋(lin)巴結等組織(zhi)約(yue)1g，置壹1.5ml的(de)潔(jie)凈離心(xin)管(guan)中，密閉送檢。

3.應(ying)避免(mian)標本間交叉汙染。

4.標本收集後可(ke)立(li)即檢測；若(ruo)不(bu)能(neng)立(li)即檢(jian)測，可(ke)置於(yu)2～8℃冷(leng)藏(zang)過夜保存(cun)；如(ru)需(xu)長(chang)期保(bao)存，標本應凍(dong)存(cun)於(yu)-80℃以(yi)下，避免反(fan)復(fu)凍(dong)融(rong)。

【檢(jian)驗方法】

1. 試(shi)劑(ji)準備（試(shi)劑(ji)準備區(qu)）

（1）從(cong)冰箱(xiang)中取(qu)出(chu)試(shi)劑(ji)盒, 從(cong)試(shi)劑(ji)盒中取(qu)出(chu)實驗所需(xu)試(shi)劑(ji)，充(chong)分融(rong)化混(hun)勻(yun)並(bing)瞬(shun)時離心(xin)以去(qu)除(chu)管(guan)壁(bi)附(fu)著(zhe)液(ye)體(ti)。

（2）核算當次實(shi)驗(yan)所(suo)需要的(de)反(fan)應數（n），並(bing)根據(ju)如下表(biao)所示反(fan)應體系計(ji)算(suan)當(dang)次(ci)實驗所需要的(de)各種試(shi)劑(ji)量。

n =陰(yin)性(xing)對照(zhao)數（1T）+陽(yang)性(xing)對照(zhao)數（1T）+誤(wu)差預留(liu)量(liang)（1T）+樣(yang)本數

（3）在(zai)無菌離心(xin)管(guan)中加入(ru)上述試(shi)劑(ji)，充(chong)分混(hun)勻(yun)後瞬(shun)時離心(xin)。按照20 μL/管(guan)分裝(zhuang)量將(jiang)試(shi)劑(ji)分裝(zhuang)至(zhi)PCR反(fan)應管(guan)。

2.樣(yang)本準備（樣本處理(li)區(qu)）

用DNA/RNA提(ti)取(qu)試(shi)劑(ji)盒提(ti)取(qu)核酸(suan)即可，具(ju)體(ti)操(cao)作(zuo)按照其試(shi)劑(ji)盒說(shuo)明書操(cao)作。

3.加(jia)樣

在(zai)上述制(zhi)備好的(de)PCR反(fan)應樣本管(guan)中分別加(jia)入(ru)處理(li)好的(de)待(dai)測標本RNA各5 μl、終(zhong)體積(ji)25 μl/管(guan)，蓋(gai)好PCR反(fan)應蓋(gai)混(hun)勻(yun)後瞬(shun)時低(di)速(su)離心(xin)，轉移(yi)到PCR儀(yi)器(qi)上(shang)。陰性(xing)對照(zhao)和陽(yang)性(xing)對照(zhao)管(guan)則各加5 μL試(shi)劑(ji)盒自(zi)帶的(de)陰(yin)性(xing)對照(zhao)或(huo)陽(yang)性(xing)對照(zhao)品(pin)，終(zhong)體(ti)積(ji)為(wei)25 μl/管(guan)，蓋(gai)好PCR反(fan)應蓋(gai)混(hun)勻(yun)後瞬(shun)時低(di)速(su)離心(xin)，轉移(yi)到PCR儀(yi)器(qi)上(shang)。

4. PCR（PCR擴(kuo)增(zeng)區(qu)）

 （1）取(qu)樣(yang)本處理(li)區(qu)準備好的(de)PCR反(fan)應管(guan)，放(fang)置在(zai)實時(shi)熒(ying)光(guang)定量(liang)PCR儀(yi)樣品(pin)槽(cao)相(xiang)應(ying)位置，並(bing)記(ji)錄放(fang)置順序。

（2）按下表(biao)設置儀(yi)器(qi)核酸(suan)擴(kuo)增(zeng)相關參(can)數進行(xing)PCR擴(kuo)增(zeng)。

註(zhu)：ABI系(xi)列熒(ying)光(guang)PCR儀(yi)在(zai)設置時(shi)不(bu)選ROX校(xiao)正(zheng)，設置淬(cui)滅(mie)基(ji)團選擇None。

【參(can)考值（參考範圍(wei)）】

1.試(shi)劑(ji)盒有(you)效(xiao)性(xing)判(pan)定：

 （1）陽(yang)性(xing)對照(zhao)：有典(dian)型S型(xing)擴(kuo)增(zeng)曲線或(huo)Ct值≤35。

 （2）陰(yin)性(xing)對照(zhao)：Ct值＞38或(huo)無Ct值，線形為(wei)直線或(huo)輕(qing)微(wei)斜(xie)線，無指(zhi)數增(zeng)長期。

2.標本結果判定：

（1）陽(yang)性(xing)：標本檢測結果Ct值≤35或(huo)有(you)明(ming)顯(xian)指(zhi)數增(zeng)長期。

（2）可(ke)疑：標本檢測結果Ct值在(zai)35～38範(fan)圍(wei)內(nei)。此(ci)時(shi)應對標本進行(xing)重復(fu)檢測，如重復(fu)實驗(yan)結果Ct值仍在(zai)35～38範(fan)圍(wei)內(nei)，有(you)明(ming)顯(xian)指(zhi)數增(zeng)長期，則判(pan)定為(wei)陽(yang)性(xing)，否(fou)則為(wei)陰性(xing)。

（3）陰(yin)性(xing)：標本檢測結果Ct值＞38或(huo)無Ct值。

【檢(jian)驗結(jie)果的(de)解(jie)釋(shi)】

【檢(jian)驗方法的(de)局(ju)限(xian)性(xing)】

1. 當(dang)檢測樣本中被檢核酸(suan)濃(nong)度(du)低(di)於(yu)本試(shi)劑(ji)盒的(de)最(zui)di檢(jian)出限(xian)shi可(ke)能會(hui)發生(sheng)假陰性(xing)的(de)結(jie)果。

2. 被(bei)檢樣(yang)本在(zai)采集、運(yun)輸、儲存(cun)以(yi)及處理(li)過程(cheng)中操作方式不(bu)當(dang)容易(yi)造(zao)成(cheng)RNA降解(jie)而產(chan)生(sheng)假陰性(xing)結(jie)果。

3. 樣(yang)本在(zai)采集、運(yun)輸、儲存(cun)以(yi)及處理(li)過程(cheng)中發生(sheng)交叉汙染，則容(rong)易(yi)得到(dao)假陽(yang)性(xing)結(jie)果。

【產(chan)品(pin)性(xing)能(neng)指(zhi)標】 產(chan)品(pin)的(de)最(zui)di檢(jian)出限(xian)為(wei)10³ Copies/mL，產(chan)品(pin)CV值≤3%。

【註(zhu)意(yi)事項】

1. 使(shi)用本試(shi)劑(ji)盒的(de)實(shi)驗(yan)室，應嚴(yan)格按照國家有關(guan)部(bu)分頒(ban)布的(de)有(you)關(guan)基(ji)因(yin)擴(kuo)增(zeng)檢驗實(shi)驗室管(guan)理(li)規(gui)範(fan)進行(xing)管(guan)理(li)；

2. 為(wei)避免(mian)RNA降解(jie)，樣(yang)本處理(li)過程(cheng)應(ying)在(zai)0-4℃條(tiao)件下操作，且完成(cheng)實驗(yan)後立(li)即上機檢(jian)測；樣本處理(li)過程(cheng)中使用的(de)器(qi)具(ju)耗(hao)材(cai)應經過無核酶處(chu)理(li)；

3. 各區(qu)域物(wu)品(pin)均(jun)為(wei)專(zhuan)用，不(bu)得交(jiao)叉使用，以(yi)免(mian)汙染；檢測結束(shu)後，應立(li)即對工(gong)作臺(tai)清(qing)潔(jie)；

4. 吸(xi)取(qu)反(fan)應液(ye)時(shi)，應盡量避免(mian)產(chan)生(sheng)氣泡(pao)；上(shang) PCR 儀(yi)前，應註(zhu)意(yi)檢查各反(fan)應管(guan)是否蓋(gai)緊，以(yi)免液(ye)體(ti)蒸(zheng)發造(zao)成(cheng)結果不(bu)準確(que)；

5. 試(shi)劑(ji)盒所(suo)有(you)試(shi)劑(ji)在(zai)使用前應該(gai)在(zai)常(chang)溫下充(chong)分融(rong)化混(hun)勻(yun)，並(bing)應瞬(shun)時離心(xin)；

6. 試(shi)劑(ji)盒內(nei)所(suo)配(pei)陰性(xing)和陽(yang)性(xing)對照(zhao)在(zai)第壹次使(shi)用前應全(quan)部(bu)轉(zhuan)移(yi)至(zhi)標本準備區(qu)，並(bing)單獨(du)存放(fang)；

7. 為(wei)防(fang)止(zhi)熒(ying)光(guang)幹擾，應(ying)避(bi)免裸(luo)手(shou)直接接觸PCR反(fan)應管(guan)，並(bing)應避(bi)免在(zai)PCR反(fan)應管(guan)上(shang)進行(xing)任(ren)何標記(ji)；

8. 檢(jian)測過程中使用過(guo)的(de)吸(xi)頭，應直接打到(dao)盛(sheng)有 10%次(ci)氯(lv)酸(suan)的(de)廢物缸內(nei)，檢(jian)測結束(shu)的(de)PCR 反(fan)應管(guan)，切(qie)忌(ji)開(kai)蓋(gai)，並(bing)與其他(ta)廢棄(qi)物(wu)品(pin)壹同滅菌(jun)後丟(diu)棄(qi)；工(gong)作臺(tai)及各種實驗用品(pin)應(ying)定期(qi)用 10%次(ci)氯(lv)酸(suan)、75%酒(jiu)精或(huo)紫(zi)外燈進行(xing)消毒(du)；

9. 儀(yi)器(qi)擴(kuo)增(zeng)相關參(can)數應(ying)按照本說(shuo)明書相(xiang)關要求進行(xing)設(she)置；不(bu)同批(pi)號試(shi)劑(ji)不(bu)能(neng)混(hun)用；並(bing)在(zai)有效(xiao)期內(nei)使(shi)用。