狂(kuang)犬病毒PCR檢測(ce)試劑(ji)盒簡(jian)介

【產(chan)品名稱(cheng)】

通(tong)用(yong)名稱(cheng)：狂(kuang)犬病毒檢測(ce)試劑(ji)盒（實(shi)時熒光PCR法）

英文(wen)名稱(cheng)：Rabies virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包(bao)裝(zhuang)規(gui)格】 25T/盒 & 50T/盒

【預期用(yong)途(tu)】

本試劑(ji)盒利(li)用(yong)實時(shi)熒光PCR原(yuan)理(li)，定性檢測(ce)狂(kuang)犬病毒，對(dui)狂(kuang)犬病毒的(de)診(zhen)斷和(he)監(jian)控(kong)具(ju)有重(zhong)要(yao)指(zhi)導(dao)意義(yi)。

【檢驗原(yuan)理(li)】

本試劑(ji)盒針(zhen)對(dui)手(shou)狂(kuang)犬病毒基(ji)因(yin)組高(gao)度保(bao)守(shou)區域(yu)設計(ji)特異(yi)性引物(wu)和(he)探(tan)針(zhen)，在反應體系中(zhong)含狂(kuang)犬病毒基(ji)因(yin)組模板(ban)的情況(kuang)下(xia)，PCR反應得(de)以進(jin)行並(bing)釋(shi)放(fang)熒光(guang)信號(hao)。利(li)用(yong)熒光(guang)定量PCR儀對PCR過程中(zhong)相應通(tong)道(dao)信號(hao)進(jin)行實(shi)時監(jian)測(ce)和(he)輸(shu)出，實(shi)現(xian)檢測(ce)結果的定性分(fen)析。

【主要(yao)組(zu)成(cheng)成(cheng)份】

註(zhu)：陰性對(dui)照(zhao)為滅(mie)菌(jun)純(chun)水(shui)，陽性對(dui)照(zhao)為含狂(kuang)犬病靶(ba)基(ji)因(yin)的質粒(li)。

【儲存(cun)條件(jian)及(ji)有效(xiao)期(qi)】避光-20℃以下(xia)保存(cun)，避免(mian)反復凍(dong)融(rong)，有效(xiao)期(qi)12個月。

【適用(yong)儀器(qi)】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler 480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州(zhou)博(bo)日系(xi)列等(deng)多(duo)通(tong)道(dao)實時(shi)熒(ying)光定量PCR儀。

【樣(yang)本要(yao)求(qiu)】

1.組織(zhi)樣(yang)品：無菌(jun)條件(jian)下(xia)取(qu)動(dong)物(wu)組(zu)織(zhi)（腦組(zu)織(zhi)、角(jiao)膜(mo)或皮(pi)膚組織(zhi)）約(yue)0.5克於研磨管中(zhong)，加入100 μL Trizol研碎，再加(jia)入500 μLTrizol制成懸液(ye)備用(yong)。

2.唾(tuo)液、鼻(bi)咽洗(xi)液(ye)：生(sheng)理(li)鹽水(shui)漱(shu)口後(hou)，取(qu)唾(tuo)液、鼻(bi)咽洗(xi)液(ye)等(deng)約(yue)5mL ，備用(yong)。

3.血(xue)液(ye)或血(xue)清(qing)樣(yang)品：使(shi)用(yong)無菌(jun)註(zhu)射液抽取(qu)樣(yang)品置於離(li)心(xin)管中(zhong)待檢。

4.應避(bi)免(mian)標本間交叉(cha)汙染。

5.樣(yang)本收集後(hou)可立(li)即(ji)檢測(ce)；若不(bu)能(neng)立(li)即(ji)檢測(ce)，可置於2～8℃冷(leng)藏(zang)過(guo)夜(ye)保存(cun)；如(ru)需(xu)長(chang)期保(bao)存(cun)，標本應凍(dong)存(cun)於-70℃以下(xia)，避免(mian)反復凍(dong)融(rong)。

【檢驗方法】

1. 試劑(ji)準備（試(shi)劑(ji)準備區(qu)）

（1）從(cong)冰箱中(zhong)取(qu)出試(shi)劑(ji)盒, 從(cong)試(shi)劑(ji)盒中(zhong)取(qu)出實(shi)驗所需(xu)試(shi)劑(ji),充分融(rong)化混勻(yun)並瞬時離(li)心(xin)以去(qu)除(chu)管壁附(fu)著(zhe)液(ye)體。

（2）核算(suan)當(dang)次(ci)實(shi)驗所需(xu)要(yao)的(de)反應數(shu)（n），並根(gen)據如(ru)下(xia)表所(suo)示反應體系計(ji)算(suan)當(dang)次(ci)實(shi)驗所需(xu)要(yao)的(de)各(ge)種(zhong)試(shi)劑(ji)量。

n =陰性對(dui)照(zhao)數（1T）+陽性對(dui)照(zhao)數（1T）+誤差預留(liu)量（1T）+樣(yang)本數

 （3）在無(wu)菌(jun)離(li)心(xin)管中(zhong)加入上(shang)述(shu)試(shi)劑(ji)，充分(fen)混勻(yun)後(hou)瞬時離(li)心(xin)。按照(zhao)20 μL/管分裝(zhuang)量(liang)將(jiang)試劑(ji)分裝(zhuang)至(zhi)PCR反應管。

2.樣(yang)本準備（樣(yang)本處理(li)區）

用(yong)DNA/RNA提(ti)取(qu)試(shi)劑(ji)盒提(ti)取(qu)核(he)酸(suan)即(ji)可，具體操(cao)作按(an)照(zhao)其試劑(ji)盒說(shuo)明書操(cao)作。

3.加樣(yang)

  在上(shang)述(shu)制(zhi)備好(hao)的PCR反應管中(zhong)分別(bie)加(jia)入處(chu)理(li)好的待測(ce)標本RNA各5 μl、終體積(ji)25 μl/管，蓋(gai)好(hao)PCR反應蓋(gai)混(hun)勻(yun)後(hou)瞬時低(di)速離(li)心(xin)，轉移到PCR儀器(qi)上(shang)。根(gen)據需(xu)要(yao)，在上(shang)述(shu)準備好(hao)的PCR反應管中(zhong)分別(bie)加(jia)入陰性對(dui)照(zhao)品以及陽性對(dui)照(zhao)品各5 μl，終體積(ji)為25 μl/管，蓋(gai)好(hao)PCR反應蓋(gai)混(hun)勻(yun)後(hou)瞬時低(di)速離(li)心(xin)，轉移到PCR儀器(qi)上(shang)。

4. PCR（PCR擴增區）

（1）取(qu)樣(yang)本處理(li)區準備好(hao)的PCR反應管，放(fang)置在實(shi)時熒(ying)光定量PCR儀樣(yang)品槽相應位置(zhi)，並(bing)記(ji)錄(lu)放(fang)置順(shun)序。

（2）按下(xia)表設(she)置儀(yi)器(qi)核酸(suan)擴(kuo)增相(xiang)關(guan)參(can)數(shu)進(jin)行PCR擴增。

註(zhu)：ABI系列熒光(guang)PCR儀在設(she)置時(shi)不(bu)選(xuan)ROX校正，設(she)置(zhi)淬(cui)滅(mie)基(ji)團選(xuan)擇(ze)None。

【參(can)考(kao)值(zhi)（參(can)考(kao)範圍）】

1.試劑(ji)盒有效(xiao)性判(pan)定：

（1）陽性對(dui)照(zhao)：有典(dian)型(xing)S型(xing)擴(kuo)增(zeng)曲線(xian)或Ct值(zhi)≤35。

（2）陰性對(dui)照(zhao)：Ct值(zhi)＞38或無Ct值(zhi)，線(xian)形(xing)為直(zhi)線(xian)或輕微斜(xie)線(xian)，無(wu)指數(shu)增(zeng)長期(qi)。

2.標本結果判定：

（1）陽性：標本檢測(ce)結果Ct值(zhi)≤35或有明顯(xian)指(zhi)數(shu)增(zeng)長期。

（2）可疑：標本檢測(ce)結果Ct值(zhi)在35～38範圍內。此時(shi)應對(dui)標本進(jin)行重(zhong)復(fu)檢測(ce)，如(ru)重(zhong)復(fu)實驗結果Ct值(zhi)仍(reng)在35～38範圍內，有明顯(xian)指(zhi)數(shu)增(zeng)長期，則(ze)判(pan)定為陽(yang)性，否(fou)則(ze)為(wei)陰性。

（3）陰性：標本檢測(ce)結果Ct值(zhi)＞38或無Ct值(zhi)。

【檢驗結果的解(jie)釋(shi)】

【檢驗方法的局限(xian)性】

1. 當(dang)檢測(ce)樣(yang)本中(zhong)被檢核(he)酸(suan)濃(nong)度低(di)於本試劑(ji)盒的(de)最di檢出限shi可能會發(fa)生(sheng)假陰性的(de)結果。

2. 被檢樣(yang)本在采(cai)集、運(yun)輸(shu)、儲存(cun)以及處(chu)理(li)過程中(zhong)操(cao)作方(fang)式不(bu)當(dang)容易造成RNA降解(jie)而(er)產(chan)生假陰性結(jie)果。

3. 樣(yang)本在采(cai)集、運(yun)輸(shu)、儲存(cun)以及處(chu)理(li)過程中(zhong)發(fa)生(sheng)交叉(cha)汙染，則(ze)容易得到假陽(yang)性結(jie)果。

【產(chan)品性能(neng)指標】 產(chan)品的(de)最di檢出限(xian)為(wei)10³ Copies/mL，產(chan)品CV值(zhi)≤3%。

【註(zhu)意事(shi)項】

1. 使(shi)用(yong)本試劑(ji)盒的(de)實驗室，應嚴(yan)格按照(zhao)國(guo)家(jia)有關(guan)部分(fen)頒布的有關(guan)基(ji)因(yin)擴增檢驗實驗室管理(li)規(gui)範進(jin)行管理(li)；

2. 為避免(mian)RNA降解(jie)，樣(yang)本處理(li)過程應在0-4℃條件(jian)下(xia)操(cao)作，且(qie)完成實驗後(hou)立即(ji)上(shang)機(ji)檢測(ce)；樣(yang)本處理(li)過程中(zhong)使(shi)用(yong)的器(qi)具耗(hao)材應經(jing)過(guo)無核酶處(chu)理(li)；

3. 各區域物(wu)品(pin)均為專用(yong)，不(bu)得(de)交叉(cha)使(shi)用(yong)，以免(mian)汙染；檢測(ce)結束(shu)後(hou)，應立(li)即對工(gong)作臺(tai)清(qing)潔；

4. 吸取(qu)反應液(ye)時，應盡(jin)量避免(mian)產(chan)生氣(qi)泡；上(shang) PCR 儀前(qian)，應註(zhu)意檢查(zha)各反應管是否蓋(gai)緊，以(yi)免(mian)液(ye)體蒸發(fa)造成結(jie)果不(bu)準確(que)；

5. 試劑(ji)盒所(suo)有試(shi)劑(ji)在使(shi)用(yong)前(qian)應該(gai)在常(chang)溫下(xia)充分(fen)融(rong)化混勻(yun)，並應瞬時離(li)心；

6. 試劑(ji)盒內(nei)所配陰性和(he)陽性對(dui)照(zhao)在第(di)壹次(ci)使(shi)用(yong)前(qian)應全部轉(zhuan)移至(zhi)標本準備區(qu)，並單(dan)獨(du)存(cun)放(fang)；

7. 為防止熒(ying)光(guang)幹(gan)擾(rao)，應避(bi)免(mian)裸(luo)手(shou)直(zhi)接接觸(chu)PCR反應管，並應避(bi)免(mian)在PCR反應管上(shang)進(jin)行任(ren)何(he)標記(ji)；

8. 檢測(ce)過程中(zhong)使(shi)用(yong)過的(de)吸頭(tou)，應直(zhi)接打(da)到盛(sheng)有 10%次氯(lv)酸(suan)的(de)廢(fei)物(wu)缸內，檢測(ce)結束(shu)的PCR 反應管，切忌開(kai)蓋(gai)，並(bing)與(yu)其他(ta)廢(fei)棄物(wu)品(pin)壹同(tong)滅(mie)菌(jun)後(hou)丟棄；工作臺(tai)及(ji)各種實(shi)驗用(yong)品應定期用(yong) 10%次氯(lv)酸(suan)、75%酒精(jing)或紫(zi)外燈進(jin)行消(xiao)毒；

9. 儀器(qi)擴增(zeng)相關(guan)參(can)數(shu)應按(an)照(zhao)本說(shuo)明書相關(guan)要(yao)求(qiu)進(jin)行設(she)置；不(bu)同(tong)批(pi)號(hao)試(shi)劑(ji)不(bu)能(neng)混(hun)用(yong)；並在有效(xiao)期(qi)內(nei)使(shi)用(yong)。