豬圓(yuan)環病毒(du)PCR檢測(ce)試(shi)劑盒(he)說明書

豬(zhu)圓(yuan)環病毒(du)檢測(ce)試(shi)劑盒(he)（實(shi)時(shi)熒光(guang)PCR法）說明書

通(tong)用(yong)名稱(cheng)：豬(zhu)圓(yuan)環病毒(du)檢(jian)測(ce)試(shi)劑盒(he)（實(shi)時(shi)熒光(guang)PCR法）

英(ying)文(wen)名稱(cheng)：Porcine Circovirus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包(bao)裝(zhuang)規格(ge)】 25T/盒(he) ＆ 50T/盒(he)

【預(yu)期(qi)用(yong)途】

豬(zhu)圓(yuan)環病毒(du)（porcine circovirus，PCV）在(zai)分類(lei)學(xue)上(shang)屬圓(yuan)環病毒(du)科圓(yuan)環病毒(du)屬，為已(yi)知(zhi)的(de)最小(xiao)的(de)動物病毒之(zhi)壹(yi)。本試劑盒(he)利(li)用(yong)實(shi)時(shi)熒光(guang)PCR原(yuan)理(li)，定性(xing)檢(jian)測(ce)豬(zhu)圓(yuan)環病毒(du)，對(dui)豬(zhu)圓(yuan)環病毒(du)引(yin)起(qi)的(de)豬的(de)疫病的(de)診(zhen)斷和監(jian)控(kong)具(ju)有(you)重(zhong)要(yao)指(zhi)導意(yi)義(yi)。

【檢(jian)驗(yan)原理(li)】

本試劑盒(he)針(zhen)對(dui)PCV高(gao)度(du)保守(shou)區(qu)域(yu)設計(ji)特(te)異性(xing)引(yin)物(wu)和探(tan)針(zhen)，在(zai)反應體系中含(han)PCV基(ji)因(yin)組(zu)模板(ban)的(de)情(qing)況(kuang)下(xia)，PCR反(fan)應得以(yi)進行並釋放(fang)熒光(guang)信號(hao)。利(li)用(yong)儀(yi)器對(dui)PCR過(guo)程中(zhong)相應通(tong)道的(de)信號(hao)強(qiang)度(du)進行實(shi)時(shi)監(jian)測(ce)和輸(shu)出，實(shi)現檢測(ce)結(jie)果的(de)定性(xing)分(fen)析(xi)。

【主(zhu)要(yao)組(zu)成(cheng)成(cheng)份(fen)】

註(zhu)：陰(yin)性(xing)對(dui)照(zhao)為滅(mie)菌純(chun)水(shui)，陽(yang)性(xing)對(dui)照(zhao)為含(han)PCV靶(ba)基(ji)因(yin)的(de)質(zhi)粒(li)。

【儲(chu)存(cun)條(tiao)件及有效期】避(bi)光(guang)-20℃以(yi)下(xia)保存(cun)，避(bi)免反復凍(dong)融，有效期12個(ge)月(yue)。

【適用(yong)儀(yi)器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler 480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭(hang)州(zhou)博日(ri)系列等(deng)多(duo)通(tong)道實(shi)時(shi)熒光(guang)定量(liang)PCR儀(yi)。

【樣(yang)本要(yao)求(qiu)】

1. 新(xin)鮮采(cai)集(ji)的(de)咽拭(shi)子、鼻拭(shi)子和糞(fen)便(bian)標(biao)本，並使用(yong)滅菌生(sheng)理鹽(yan)水懸浮(fu)。

2. 標(biao)本收集(ji)後(hou)若不能立(li)即檢(jian)測(ce)，可(ke)置於(yu)2～8℃冷(leng)藏(zang)過夜(ye)保存(cun)；如(ru)需長期保存，標(biao)本應凍(dong)存(cun)於(yu)-20℃～-80℃。

3. 標(biao)本保存(cun)期(qi)間(jian)應避免反復凍(dong)融。

【檢(jian)驗(yan)方(fang)法】

1. 試(shi)劑準(zhun)備(bei)（試劑準(zhun)備(bei)區(qu)）

（1）從冰(bing)箱(xiang)中取(qu)出試劑盒(he), 從試(shi)劑盒(he)中(zhong)取(qu)出實(shi)驗所(suo)需試劑，充分(fen)融化混(hun)勻(yun)並瞬(shun)時(shi)離(li)心(xin)以(yi)去除(chu)管(guan)壁附(fu)著(zhe)液(ye)體。

（2）核算(suan)當(dang)次實(shi)驗所(suo)需要(yao)的(de)反應數（n），並根據(ju)如(ru)下(xia)表所(suo)示反(fan)應體系計(ji)算(suan)當(dang)次實(shi)驗所(suo)需要(yao)的(de)各種(zhong)試劑量(liang)。

n =陰(yin)性(xing)對(dui)照(zhao)數（1T）+陽(yang)性(xing)對(dui)照(zhao)數（1T）+誤(wu)差預留(liu)量（1T）+樣(yang)本數

（3）在(zai)無菌離(li)心(xin)管(guan)中加入上(shang)述試劑，充分(fen)混(hun)勻(yun)後(hou)瞬(shun)時(shi)離(li)心(xin)。按(an)照(zhao)20 μL/管(guan)分裝(zhuang)量(liang)將(jiang)試劑分(fen)裝至PCR反(fan)應管(guan)。

（4）蓋(gai)緊(jin)PCR反(fan)應管(guan)蓋後(hou)將(jiang)PCR反(fan)應管(guan)轉移(yi)至樣本處理區(qu)。剩(sheng)余(yu)試(shi)劑放(fang)回(hui)-20℃以(yi)下(xia)冰箱(xiang)冷凍(dong)保(bao)存。

2.樣(yang)本準備(bei)（樣本處理區(qu)）

用(yong)DNA/RNA提(ti)取(qu)試劑盒(he)提(ti)取(qu)核酸(suan)即可(ke)，具(ju)體(ti)操(cao)作(zuo)按(an)照(zhao)其(qi)試(shi)劑盒(he)說明書操(cao)作(zuo)。

3.加樣

在(zai)上(shang)述制備(bei)好的(de)PCR反(fan)應樣本管(guan)中分(fen)別(bie)加入處理好的(de)待測(ce)標(biao)本DNA各(ge)5μl、終(zhong)體(ti)積(ji)25μl/管(guan)，蓋好(hao)PCR反(fan)應蓋混(hun)勻(yun)後(hou)瞬(shun)時(shi)低速離(li)心(xin)，轉移到(dao)PCR儀(yi)器上(shang)。陰性(xing)對(dui)照(zhao)和陽(yang)性(xing)對(dui)照(zhao)管(guan)則(ze)各(ge)加5μL試(shi)劑盒(he)自(zi)帶(dai)的(de)陰性(xing)對(dui)照(zhao)或(huo)陽性(xing)對(dui)照(zhao)品，終(zhong)體(ti)積(ji)為25μl/管(guan)，蓋好(hao)PCR反(fan)應蓋混(hun)勻(yun)後(hou)瞬(shun)時(shi)低速離(li)心(xin)，轉移到(dao)PCR儀(yi)器上(shang)。

4.PCR（PCR擴(kuo)增(zeng)區(qu)）

（1）取(qu)樣本處理區(qu)準備(bei)好的(de)PCR反(fan)應管(guan)，放(fang)置在(zai)實(shi)時(shi)熒光(guang)定量(liang)PCR儀(yi)樣品槽(cao)相應位置，並記錄放(fang)置順序(xu)。

（2）按(an)下(xia)表設置儀(yi)器核酸(suan)擴(kuo)增(zeng)相關參數進行PCR擴(kuo)增(zeng)。

註(zhu)：ABI系列熒(ying)光(guang)PCR儀(yi)在(zai)設置時(shi)不選ROX校(xiao)正，設(she)置淬滅基(ji)團(tuan)選擇None。

【參(can)考(kao)值（參(can)考範圍）】

1.試(shi)劑盒(he)有(you)效性(xing)判(pan)定：

（1）陽(yang)性(xing)對(dui)照(zhao)：有(you)典型S型擴(kuo)增(zeng)曲線或(huo)Ct值(zhi)≤35。

（2）陰(yin)性(xing)對(dui)照(zhao)：Ct值(zhi)＞38或(huo)無(wu)Ct值(zhi)，線形為直線或(huo)輕微(wei)斜(xie)線，無(wu)指(zhi)數增(zeng)長期。

2.標(biao)本結果(guo)判(pan)定：

（1）陽(yang)性(xing)：標(biao)本檢測(ce)結(jie)果Ct值(zhi)≤35或(huo)有(you)明顯指(zhi)數增(zeng)長期。

（2）可(ke)疑(yi)：標(biao)本檢測(ce)結(jie)果Ct值(zhi)在(zai)35～38範圍內(nei)。此(ci)時(shi)應對(dui)標(biao)本進行重復檢測(ce)，如(ru)重復實(shi)驗結(jie)果Ct值(zhi)仍(reng)在(zai)35～38範圍內(nei)，有(you)明顯指(zhi)數增(zeng)長期，則(ze)判(pan)定為陽(yang)性(xing)，否則(ze)為陰(yin)性(xing)。

（3）陰(yin)性(xing)：標(biao)本檢測(ce)結(jie)果Ct值(zhi)＞38或(huo)無(wu)Ct值(zhi)。

【檢(jian)驗(yan)結果(guo)的(de)解釋】

【檢(jian)驗(yan)方(fang)法的(de)局限性(xing)】

1. 當(dang)檢測(ce)樣(yang)本中被檢核酸(suan)濃度(du)低於(yu)本試劑盒(he)的(de)最di檢(jian)出限shi可(ke)能(neng)會(hui)發生(sheng)假(jia)陰(yin)性(xing)的(de)結果(guo)。

2. 被檢樣本在(zai)采集(ji)、運輸(shu)、儲(chu)存以(yi)及處理過程中(zhong)操(cao)作(zuo)方(fang)式(shi)不當(dang)容易造(zao)成(cheng)DNA降解而(er)產生(sheng)假(jia)陰(yin)性(xing)結(jie)果(guo)。

3. 樣(yang)本在(zai)采集(ji)、運輸(shu)、儲(chu)存以(yi)及處理過程中(zhong)發生(sheng)交叉(cha)汙(wu)染，則(ze)容易得(de)到(dao)假(jia)陽(yang)性(xing)結(jie)果(guo)。

【產(chan)品性(xing)能(neng)指(zhi)標(biao)】 產(chan)品的(de)最di檢(jian)出限為10³Copies/mL，產(chan)品CV值(zhi)≤3%。

【註(zhu)意(yi)事項(xiang)】

1. 使(shi)用(yong)本試劑盒(he)的(de)實(shi)驗室(shi)，應嚴格(ge)按(an)照(zhao)國(guo)家(jia)有(you)關(guan)部分頒布的(de)有關(guan)基(ji)因(yin)擴(kuo)增(zeng)檢驗實(shi)驗室(shi)管(guan)理規(gui)範進行管(guan)理；

2. 為避(bi)免RNA降解，樣(yang)本處理過程應在(zai)0-4℃條(tiao)件下(xia)操(cao)作(zuo)，且完(wan)成(cheng)實(shi)驗後(hou)立即上(shang)機檢(jian)測(ce)；樣(yang)本處理過程中(zhong)使(shi)用(yong)的(de)器具(ju)耗(hao)材應經過無(wu)核酶(mei)處理；

3. 各(ge)區(qu)域(yu)物品均為專(zhuan)用(yong)，不得交(jiao)叉(cha)使用(yong)，以(yi)免汙(wu)染；檢(jian)測(ce)結(jie)束後(hou)，應立即對(dui)工(gong)作臺(tai)清(qing)潔；

4. 吸取(qu)反應液(ye)時(shi)，應盡量避免(mian)產(chan)生(sheng)氣泡(pao)；上(shang) PCR 儀(yi)前，應註意檢查(zha)各(ge)反(fan)應管(guan)是否蓋(gai)緊(jin)，以(yi)免液(ye)體蒸(zheng)發造成(cheng)結果(guo)不準確(que)；

5. 試(shi)劑盒(he)所(suo)有(you)試(shi)劑在(zai)使用(yong)前應該在(zai)常溫下(xia)充分(fen)融化混(hun)勻(yun)，並應瞬(shun)時(shi)離(li)心(xin)；

6. 試(shi)劑盒(he)內(nei)所(suo)配陰(yin)性(xing)和陽(yang)性(xing)對(dui)照(zhao)在(zai)第壹(yi)次(ci)使用(yong)前應全(quan)部轉移至標(biao)本準備(bei)區(qu)，並單(dan)獨存(cun)放(fang)；

7. 為防止(zhi)熒(ying)光(guang)幹擾(rao)，應避免裸(luo)手直接(jie)接(jie)觸PCR反(fan)應管(guan)，並應避免在(zai)PCR反(fan)應管(guan)上(shang)進行任何標(biao)記；

8. 檢(jian)測(ce)過(guo)程中(zhong)使(shi)用(yong)過的(de)吸頭，應直接(jie)打到(dao)盛有(you) 10%次(ci)氯(lv)酸(suan)的(de)廢物(wu)缸內，檢測(ce)結(jie)束的(de)PCR 反(fan)應管(guan)，切忌(ji)開(kai)蓋(gai)，並與其(qi)他(ta)廢(fei)棄物品壹同(tong)滅(mie)菌後(hou)丟(diu)棄；工(gong)作(zuo)臺及(ji)各種實(shi)驗用(yong)品應定期(qi)用(yong) 10%次(ci)氯(lv)酸(suan)、75%酒精(jing)或紫(zi)外(wai)燈進行消(xiao)毒；

9. 儀(yi)器擴(kuo)增(zeng)相關參數應按(an)照(zhao)本說明書相關要(yao)求(qiu)進行設置；不同(tong)批(pi)號(hao)試(shi)劑不能混(hun)用(yong)；並在(zai)有效期內使用(yong)。