豬圓環(huan)病毒I型(xing)PCR檢測(ce)試(shi)劑(ji)盒(he)說明(ming)書(shu)

豬圓環(huan)病毒I型(xing)檢測(ce)試(shi)劑(ji)盒(he)（實時(shi)熒(ying)光(guang)PCR法(fa)）說明(ming)書(shu)病

通(tong)用(yong)名稱：豬圓環(huan)病毒I型(xing)檢測(ce)試(shi)劑(ji)盒(he)（實時(shi)熒(ying)光(guang)PCR法(fa)）

英文名稱：Porcine Circovirus I Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝(zhuang)規(gui)格】 25T/盒(he) ＆ 50 T/盒(he)

【預期(qi)用(yong)途】

豬圓環(huan)病毒（porcine circovirus，PCV）在(zai)分類學(xue)上(shang)屬圓(yuan)環(huan)病毒科(ke)圓環(huan)病毒屬(shu)，為(wei)已知(zhi)的最(zui)小的動(dong)物病毒之(zhi)壹(yi)。本試(shi)劑(ji)盒(he)利用(yong)實時(shi)熒(ying)光(guang)PCR原(yuan)理(li)，定性檢測(ce)PCV-I 型(xing)，對PCV-I 型(xing)引起(qi)的豬的疫(yi)病的診斷(duan)和(he)監控具(ju)有(you)重要(yao)指(zhi)導(dao)意(yi)義(yi)。

【檢驗原(yuan)理(li)】

本試(shi)劑(ji)盒(he)針對(dui)PCVI型(xing)基因(yin)組高(gao)度(du)保守(shou)區(qu)域(yu)設(she)計特異(yi)性引(yin)物和(he)探(tan)針，在(zai)反(fan)應(ying)體系(xi)中(zhong)含PCVII型(xing)基因(yin)組模板的情(qing)況下(xia)，PCR反(fan)應(ying)得以進(jin)行(xing)並(bing)釋放熒(ying)光(guang)信(xin)號(hao)。利用(yong)儀(yi)器(qi)對(dui)PCR過(guo)程(cheng)中相(xiang)應(ying)通(tong)道的信(xin)號(hao)強(qiang)度(du)進行(xing)實時(shi)監測(ce)和(he)輸出，實現檢測(ce)結果(guo)的定性分析(xi)。

【主要(yao)組(zu)成(cheng)成(cheng)份】

註：陰(yin)性對(dui)照為(wei)滅(mie)菌(jun)純水，陽(yang)性對(dui)照為(wei)含PCV-I 靶(ba)基因(yin)的質粒(li)。

【儲存條件(jian)及(ji)有(you)效(xiao)期(qi)】避光(guang)-20℃以下(xia)保存，避(bi)免反(fan)復凍(dong)融(rong)，有(you)效(xiao)期(qi)12個月(yue)。

【適用(yong)儀(yi)器(qi)】ABI 系(xi)列(lie)、Bio-Rad系(xi)列(lie)、Agilent Stratagene MX系(xi)列(lie)、Roche LightCycler 480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系(xi)列(lie)、杭州博日(ri)系(xi)列(lie)等(deng)多(duo)通(tong)道實時(shi)熒(ying)光(guang)定量PCR儀(yi)。

【樣本要(yao)求】

1. 新鮮(xian)采(cai)集的咽(yan)拭子、鼻拭(shi)子(zi)和(he)糞便標(biao)本，並(bing)使用(yong)滅(mie)菌(jun)生理(li)鹽水懸(xuan)浮。

2. 標(biao)本收集後若不(bu)能立(li)即(ji)檢測(ce)，可(ke)置(zhi)於2～8℃冷(leng)藏過(guo)夜(ye)保(bao)存；如需長(chang)期(qi)保存，標(biao)本應(ying)凍(dong)存(cun)於-20℃～-80℃。

3. 標(biao)本保存(cun)期(qi)間(jian)應(ying)避免反(fan)復凍(dong)融(rong)。

【檢驗方法(fa)】

1. 試(shi)劑(ji)準(zhun)備(bei)（試(shi)劑(ji)準(zhun)備(bei)區(qu)）

（1）從冰箱中(zhong)取(qu)出(chu)試(shi)劑(ji)盒(he), 從試(shi)劑(ji)盒(he)中取(qu)出(chu)實驗所需試(shi)劑(ji)，充(chong)分融(rong)化混(hun)勻(yun)並(bing)瞬(shun)時(shi)離心以去(qu)除(chu)管(guan)壁(bi)附(fu)著(zhe)液體。

（2）核算(suan)當次(ci)實驗所需要(yao)的反(fan)應(ying)數（n），並(bing)根(gen)據(ju)如下表所示(shi)反(fan)應(ying)體系(xi)計算(suan)當次(ci)實驗所需要(yao)的各(ge)種試(shi)劑(ji)量。

n =陰(yin)性對(dui)照數(shu)（1T）+陽(yang)性對(dui)照數(shu)（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數

（3）在(zai)無菌(jun)離心管(guan)中(zhong)加(jia)入(ru)上(shang)述試(shi)劑(ji)，充(chong)分混(hun)勻(yun)後瞬(shun)時(shi)離心。按(an)照(zhao)20 μL/管(guan)分裝量將試(shi)劑(ji)分裝至(zhi)PCR反(fan)應(ying)管(guan)。

（4）蓋緊PCR反(fan)應(ying)管(guan)蓋後將PCR反(fan)應(ying)管(guan)和(he)試(shi)劑(ji)盒(he)中的DNA提取(qu)液轉(zhuan)移(yi)至(zhi)樣本處(chu)理(li)區(qu)。剩余(yu)試(shi)劑(ji)放回(hui)-20℃以下(xia)冰箱冷(leng)凍(dong)保(bao)存(cun)。

2.樣本準備(bei)（樣本處(chu)理(li)區(qu)）

用(yong)DNA/RNA提取(qu)試(shi)劑(ji)盒(he)提取(qu)核酸即(ji)可(ke)，具(ju)體操作按(an)照(zhao)其(qi)試(shi)劑(ji)盒(he)說明(ming)書(shu)操(cao)作。

3.加(jia)樣

在(zai)上(shang)述制(zhi)備(bei)好(hao)的PCR反(fan)應(ying)樣本管(guan)中(zhong)分別加(jia)入(ru)處(chu)理(li)好(hao)的待(dai)測標(biao)本DNA各5 μl、終體積25 μl/管(guan)，蓋好PCR反(fan)應(ying)蓋混(hun)勻(yun)後瞬(shun)時(shi)低速(su)離(li)心，轉(zhuan)移(yi)到PCR儀(yi)器(qi)上(shang)。陰(yin)性對(dui)照和(he)陽(yang)性對(dui)照管(guan)則(ze)各加(jia)5 μL試(shi)劑(ji)盒(he)自帶(dai)的陰(yin)性對(dui)照或(huo)陽(yang)性對(dui)照品，終體積為(wei)25 μl/管(guan)，蓋好PCR反(fan)應(ying)蓋混(hun)勻(yun)後瞬(shun)時(shi)低速(su)離(li)心，轉(zhuan)移(yi)到PCR儀(yi)器(qi)上(shang)。

4.PCR（PCR擴(kuo)增區(qu)）

（1）取(qu)樣本處(chu)理(li)區(qu)準(zhun)備(bei)好(hao)的PCR反(fan)應(ying)管(guan)，放置(zhi)在(zai)實時(shi)熒(ying)光(guang)定量PCR儀(yi)樣品槽相應(ying)位置(zhi)，並(bing)記錄(lu)放置(zhi)順(shun)序。

（2）按(an)下(xia)表(biao)設(she)置(zhi)儀(yi)器(qi)核酸擴(kuo)增相(xiang)關(guan)參數(shu)進(jin)行(xing)PCR擴(kuo)增。

註：ABI系(xi)列(lie)熒(ying)光(guang)PCR儀(yi)在(zai)設(she)置(zhi)時(shi)不選(xuan)ROX校正(zheng)，設(she)置(zhi)淬(cui)滅(mie)基團(tuan)選(xuan)擇(ze)None。

【參考(kao)值(zhi)（參考(kao)範(fan)圍(wei)）】

1.試(shi)劑(ji)盒(he)有(you)效(xiao)性判定：

（1）陽(yang)性對(dui)照：有(you)典(dian)型(xing)S型(xing)擴(kuo)增曲(qu)線或(huo)Ct值(zhi)≤35。

（2）陰(yin)性對(dui)照：Ct值(zhi)＞38或(huo)無(wu)Ct值(zhi)，線(xian)形(xing)為(wei)直(zhi)線或(huo)輕(qing)微斜線(xian)，無指(zhi)數(shu)增(zeng)長(chang)期(qi)。

2.標(biao)本結果(guo)判定：

（1）陽(yang)性：標(biao)本檢測(ce)結果(guo)Ct值(zhi)≤35或(huo)有(you)明(ming)顯(xian)指數(shu)增(zeng)長(chang)期(qi)。

（2）可(ke)疑(yi)：標(biao)本檢測(ce)結果(guo)Ct值(zhi)在(zai)35～38範圍(wei)內。此時(shi)應(ying)對標(biao)本進行(xing)重復(fu)檢測(ce)，如重復(fu)實驗結果(guo)Ct值(zhi)仍(reng)在(zai)35～38範圍(wei)內，有(you)明(ming)顯(xian)指數(shu)增(zeng)長(chang)期(qi)，則(ze)判定為(wei)陽(yang)性，否(fou)則(ze)為(wei)陰(yin)性。

（3）陰(yin)性：標(biao)本檢測(ce)結果(guo)Ct值(zhi)＞38或(huo)無(wu)Ct值(zhi)。

【檢驗結果(guo)的解釋】

【檢驗方法(fa)的局(ju)限(xian)性】

1. 當檢測(ce)樣本中被檢核酸濃(nong)度(du)低於本試(shi)劑(ji)盒(he)的最(zui)di檢出(chu)限(xian)shi可(ke)能(neng)會發生(sheng)假陰(yin)性的結果(guo)。

2. 被檢樣本在(zai)采(cai)集、運輸(shu)、儲存以及(ji)處(chu)理(li)過(guo)程(cheng)中操(cao)作方式不(bu)當(dang)容易造成DNA降解而產(chan)生(sheng)假陰(yin)性結果(guo)。

3. 樣本在(zai)采(cai)集、運輸(shu)、儲存以及(ji)處(chu)理(li)過(guo)程(cheng)中發(fa)生(sheng)交(jiao)叉(cha)汙染(ran)，則(ze)容易得到假陽(yang)性結果(guo)。

【產品性能(neng)指標(biao)】 產品的最(zui)di檢出(chu)限(xian)為(wei)10³ Copies/mL，產品CV值(zhi)≤3%。

【註意(yi)事(shi)項(xiang)】

1. 使用(yong)本試(shi)劑(ji)盒(he)的實驗室，應(ying)嚴(yan)格(ge)按(an)照(zhao)國(guo)家有(you)關(guan)部(bu)分頒布(bu)的有(you)關(guan)基因(yin)擴(kuo)增檢驗實驗室管(guan)理(li)規(gui)範進行(xing)管(guan)理(li)；

2. 為(wei)避免RNA降解，樣本處(chu)理(li)過(guo)程(cheng)應(ying)在(zai)0-4℃條件(jian)下(xia)操作，且(qie)完(wan)成實驗後立(li)即(ji)上(shang)機檢測(ce)；樣本處(chu)理(li)過(guo)程(cheng)中使(shi)用(yong)的器(qi)具(ju)耗材(cai)應(ying)經(jing)過(guo)無(wu)核酶(mei)處(chu)理(li)；

3. 各區(qu)域(yu)物品均為(wei)專用(yong)，不得交(jiao)叉(cha)使用(yong)，以免汙染(ran)；檢測(ce)結束後，應(ying)立(li)即(ji)對(dui)工(gong)作臺(tai)清潔(jie)；

4. 吸取(qu)反(fan)應(ying)液時(shi)，應(ying)盡(jin)量避免產生(sheng)氣(qi)泡(pao)；上(shang) PCR 儀(yi)前(qian)，應(ying)註意(yi)檢查各(ge)反(fan)應(ying)管(guan)是(shi)否蓋緊，以免液體蒸發(fa)造成結果(guo)不準(zhun)確；

5. 試(shi)劑(ji)盒(he)所有(you)試(shi)劑(ji)在(zai)使用(yong)前應(ying)該在(zai)常溫下充(chong)分融(rong)化混(hun)勻(yun)，並(bing)應(ying)瞬(shun)時(shi)離心；

6. 試(shi)劑(ji)盒(he)內所配陰(yin)性和(he)陽(yang)性對(dui)照在(zai)第壹(yi)次(ci)使用(yong)前應(ying)全(quan)部(bu)轉(zhuan)移(yi)至(zhi)標(biao)本準備(bei)區(qu)，並(bing)單獨(du)存(cun)放；

7. 為(wei)防止(zhi)熒(ying)光(guang)幹(gan)擾(rao)，應(ying)避免裸手(shou)直(zhi)接接(jie)觸(chu)PCR反(fan)應(ying)管(guan)，並(bing)應(ying)避免在(zai)PCR反(fan)應(ying)管(guan)上(shang)進行(xing)任何(he)標(biao)記；

8. 檢測(ce)過(guo)程(cheng)中使(shi)用(yong)過(guo)的吸(xi)頭，應(ying)直(zhi)接打(da)到盛有(you) 10%次氯酸(suan)的廢(fei)物缸(gang)內，檢測(ce)結束的PCR 反(fan)應(ying)管(guan)，切忌(ji)開(kai)蓋，並(bing)與其(qi)他(ta)廢(fei)棄(qi)物品壹同(tong)滅(mie)菌(jun)後丟(diu)棄(qi)；工(gong)作臺(tai)及各(ge)種實驗用(yong)品應(ying)定期用(yong) 10%次氯酸(suan)、75%酒精(jing)或(huo)紫外(wai)燈進(jin)行(xing)消(xiao)毒(du)；

9. 儀(yi)器(qi)擴(kuo)增相(xiang)關(guan)參數(shu)應(ying)按(an)照(zhao)本說明(ming)書(shu)相(xiang)關(guan)要(yao)求進行(xing)設(she)置(zhi)；不同(tong)批號(hao)試(shi)劑(ji)不(bu)能(neng)混(hun)用(yong)；並(bing)在(zai)有(you)效(xiao)期(qi)內使用(yong)。