豬圓環(huan)病毒II型(xing)PCR檢測(ce)試劑(ji)盒說明(ming)書(shu)

豬圓環(huan)病毒II型(xing)檢(jian)測(ce)試劑(ji)盒（實(shi)時(shi)熒(ying)光PCR法）說明(ming)書(shu)

通用(yong)名(ming)稱：豬圓環(huan)病毒II型(xing)檢(jian)測(ce)試劑(ji)盒（實(shi)時(shi)熒(ying)光PCR法）

英文(wen)名(ming)稱：Porcine Circovirus II Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包(bao)裝規(gui)格】 25T/盒(he) ＆ 50T/盒(he)

【預(yu)期(qi)用途(tu)】

豬圓環(huan)病毒（porcine circovirus，PCV）在分(fen)類(lei)學(xue)上(shang)屬(shu)圓環(huan)病毒科(ke)圓環(huan)病毒屬(shu)，為(wei)已(yi)知的最(zui)小(xiao)的動(dong)物病(bing)毒之壹。本(ben)試(shi)劑盒利用(yong)實(shi)時(shi)熒(ying)光PCR原理，定(ding)性(xing)檢測(ce)豬圓環(huan)病毒II型(xing)，對豬圓環(huan)病毒II型(xing)引起(qi)的豬的疫(yi)病(bing)的診(zhen)斷(duan)和(he)監控(kong)具有重(zhong)要(yao)指(zhi)導(dao)意義(yi)。

【檢(jian)驗原理】

本(ben)試(shi)劑盒針對豬圓環(huan)病毒II型(xing)基(ji)因(yin)組(zu)高(gao)度(du)保(bao)守區(qu)域設計(ji)特(te)異性(xing)引物和(he)探針，在反(fan)應(ying)體系(xi)中含豬圓環(huan)病毒II型(xing)基(ji)因(yin)組(zu)模板的情(qing)況下，PCR反(fan)應(ying)得以(yi)進(jin)行並釋放熒(ying)光信號。利用儀器(qi)對PCR過(guo)程中相(xiang)應(ying)通道的信號強度進(jin)行實(shi)時(shi)監測(ce)和(he)輸出(chu)，實(shi)現檢測(ce)結果(guo)的定(ding)性(xing)分析。

【主(zhu)要(yao)組(zu)成(cheng)成份】

註(zhu)：陰性(xing)對照(zhao)為(wei)滅(mie)菌(jun)純(chun)水(shui)，陽性(xing)對照(zhao)為(wei)含豬圓環(huan)病毒II型(xing)靶(ba)基(ji)因(yin)的質(zhi)粒。

【儲(chu)存條件(jian)及(ji)有效(xiao)期(qi)】避(bi)光-20℃以(yi)下(xia)保(bao)存，避免反(fan)復(fu)凍(dong)融，有效(xiao)期(qi)12個月(yue)。

【適(shi)用(yong)儀器(qi)】ABI 系(xi)列、Bio-Rad系(xi)列、Agilent Stratagene MX系(xi)列、Roche LightCycler 480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系(xi)列、杭(hang)州(zhou)博日(ri)系列等(deng)多(duo)通道實(shi)時(shi)熒(ying)光定(ding)量(liang)PCR儀。

【樣(yang)本(ben)要(yao)求(qiu)】

1.血(xue)液(ye)或(huo)血(xue)清(qing)樣(yang)品：使(shi)用無(wu)菌(jun)註(zhu)射(she)液(ye)抽(chou)取樣品置(zhi)於(yu)離心(xin)管中(zhong)待(dai)檢。

2.肌肉或內(nei)臟(zang)樣品：取少(shao)量(liang)樣(yang)品（2～3克(ke)）於(yu)研缽(bo)或(huo)勻(yun)漿(jiang)器(qi)中研磨，然後(hou)將(jiang)研磨勻漿(jiang)轉(zhuan)入無(wu)菌(jun)離心(xin)管中(zhong)，3000rpm/min 離心(xin)10分(fen)鐘取上(shang)清待(dai)檢(jian)。

3.應(ying)避(bi)免標本(ben)間(jian)交叉(cha)汙(wu)染(ran)。

4.標本(ben)收(shou)集後(hou)可立即(ji)檢(jian)測(ce)；若(ruo)不能(neng)立(li)即檢測(ce)，可置(zhi)於(yu)2～8℃冷(leng)藏過(guo)夜(ye)保(bao)存；如需(xu)長期(qi)保(bao)存，標本(ben)應(ying)凍(dong)存於(yu)-80℃以(yi)下(xia)，避免反(fan)復(fu)凍(dong)融。

【檢(jian)驗方(fang)法】

1. 試(shi)劑準備(bei)（試劑(ji)準備(bei)區(qu)）

（1）從(cong)冰箱中取出(chu)試劑(ji)盒, 從(cong)試劑盒中(zhong)取出(chu)實(shi)驗所需(xu)試劑(ji)，充(chong)分(fen)融化混(hun)勻並瞬時(shi)離心(xin)以(yi)去(qu)除管(guan)壁附(fu)著(zhe)液(ye)體。

（2）核(he)算(suan)當(dang)次實(shi)驗所需(xu)要(yao)的反(fan)應(ying)數（n），並根據如下表(biao)所(suo)示反(fan)應(ying)體系(xi)計算(suan)當(dang)次實(shi)驗所需(xu)要(yao)的各種試劑(ji)量(liang)。

n =陰性(xing)對照(zhao)數（1T）+陽性(xing)對照(zhao)數（1T）+誤(wu)差(cha)預留(liu)量(liang)（1T）+樣(yang)本(ben)數

（3）在無(wu)菌(jun)離心(xin)管中(zhong)加入上(shang)述試(shi)劑(ji)，充分(fen)混(hun)勻(yun)後(hou)瞬時(shi)離心(xin)。按照(zhao)20 μL/管(guan)分裝量將(jiang)試劑(ji)分(fen)裝(zhuang)至(zhi)PCR反(fan)應(ying)管(guan)。

（4）蓋(gai)緊PCR反(fan)應(ying)管(guan)蓋(gai)後(hou)將(jiang)PCR反(fan)應(ying)管(guan)轉(zhuan)移至樣本(ben)處(chu)理區(qu)。剩余(yu)試(shi)劑放回-20℃以(yi)下(xia)冰箱冷凍(dong)保(bao)存。

2.樣(yang)本(ben)準(zhun)備(bei)（樣本(ben)處(chu)理區(qu)）

用(yong)DNA/RNA提(ti)取試劑(ji)盒(he)提取核酸(suan)即(ji)可，具體操(cao)作按照(zhao)其(qi)試劑(ji)盒(he)說明(ming)書(shu)操(cao)作。

3.加樣

在上(shang)述制(zhi)備(bei)好的PCR反(fan)應(ying)樣(yang)本(ben)管(guan)中分別加入處(chu)理好(hao)的待(dai)測(ce)標本(ben)DNA各5 μl、終(zhong)體積25 μl/管(guan)，蓋(gai)好PCR反(fan)應(ying)蓋(gai)混勻(yun)後(hou)瞬時(shi)低(di)速(su)離心(xin)，轉移到PCR儀器(qi)上(shang)。陰性(xing)對照(zhao)和(he)陽性(xing)對照(zhao)管(guan)則各加5 μL試(shi)劑盒自帶(dai)的陰性(xing)對照(zhao)或(huo)陽性(xing)對照(zhao)品，終(zhong)體積為(wei)25 μl/管(guan)，蓋(gai)好PCR反(fan)應(ying)蓋(gai)混勻(yun)後(hou)瞬時(shi)低(di)速(su)離心(xin)，轉移到PCR儀器(qi)上(shang)。

4.PCR（PCR擴(kuo)增區(qu)）

（1）取樣本(ben)處(chu)理區(qu)準備(bei)好的PCR反(fan)應(ying)管(guan)，放(fang)置(zhi)在實(shi)時(shi)熒(ying)光定(ding)量(liang)PCR儀樣(yang)品槽(cao)相應(ying)位(wei)置(zhi)，並記(ji)錄(lu)放置(zhi)順序。

（2）按下(xia)表(biao)設置(zhi)儀器(qi)核酸(suan)擴(kuo)增相(xiang)關(guan)參(can)數進(jin)行PCR擴(kuo)增。

註(zhu)：ABI系(xi)列熒(ying)光PCR儀在設置(zhi)時(shi)不(bu)選ROX校(xiao)正，設置(zhi)淬滅(mie)基(ji)團(tuan)選擇None。

【參(can)考值(zhi)（參(can)考範(fan)圍(wei)）】

1.試(shi)劑盒有效(xiao)性(xing)判定(ding)：

（1）陽性(xing)對照(zhao)：有典型(xing)S型(xing)擴(kuo)增曲線(xian)或(huo)Ct值(zhi)≤35。

（2）陰性(xing)對照(zhao)：Ct值(zhi)＞38或(huo)無Ct值(zhi)，線(xian)形(xing)為(wei)直線(xian)或(huo)輕微(wei)斜(xie)線(xian)，無(wu)指(zhi)數增長(chang)期(qi)。

2.標本(ben)結果(guo)判(pan)定(ding)：

（1）陽性(xing)：標本(ben)檢(jian)測(ce)結果(guo)Ct值(zhi)≤35或(huo)有明(ming)顯(xian)指數增長(chang)期(qi)。

（2）可疑：標本(ben)檢(jian)測(ce)結果(guo)Ct值(zhi)在35～38範(fan)圍(wei)內(nei)。此時(shi)應(ying)對標本(ben)進(jin)行重(zhong)復(fu)檢(jian)測(ce)，如重(zhong)復(fu)實(shi)驗結果(guo)Ct值(zhi)仍(reng)在35～38範(fan)圍(wei)內(nei)，有明(ming)顯(xian)指數增長(chang)期(qi)，則判定(ding)為(wei)陽性(xing)，否則為(wei)陰性(xing)。

（3）陰性(xing)：標本(ben)檢(jian)測(ce)結果(guo)Ct值(zhi)＞38或(huo)無Ct值(zhi)。

【檢(jian)驗結果(guo)的解(jie)釋】

【檢(jian)驗方(fang)法的局(ju)限(xian)性(xing)】

1. 當(dang)檢測(ce)樣本(ben)中(zhong)被檢核酸(suan)濃(nong)度低(di)於(yu)本(ben)試(shi)劑盒的最(zui)di檢(jian)出(chu)限shi可能會發(fa)生(sheng)假(jia)陰性(xing)的結果(guo)。

2. 被(bei)檢樣本(ben)在采(cai)集、運輸、儲存以(yi)及(ji)處(chu)理過(guo)程中操(cao)作(zuo)方(fang)式(shi)不當(dang)容易(yi)造(zao)成DNA降(jiang)解(jie)而產生(sheng)假(jia)陰性(xing)結果(guo)。

3. 樣(yang)本(ben)在采(cai)集、運輸、儲存以(yi)及(ji)處(chu)理過(guo)程中發(fa)生(sheng)交(jiao)叉(cha)汙(wu)染(ran)，則容易(yi)得到(dao)假(jia)陽性(xing)結果(guo)。

【產(chan)品性(xing)能指(zhi)標】 產(chan)品的最(zui)di檢(jian)出(chu)限為(wei)10³ Copies/mL，產(chan)品CV值(zhi)≤3%。

【註(zhu)意事(shi)項(xiang)】

1. 使(shi)用本(ben)試(shi)劑盒的實(shi)驗室，應(ying)嚴格按照(zhao)國(guo)家(jia)有關部(bu)分頒布的有關基(ji)因(yin)擴(kuo)增檢(jian)驗(yan)實(shi)驗室管理規(gui)範(fan)進(jin)行管理(li)；

2. 為(wei)避(bi)免RNA降(jiang)解(jie)，樣本(ben)處(chu)理過(guo)程應(ying)在0-4℃條(tiao)件(jian)下(xia)操(cao)作，且(qie)完(wan)成(cheng)實(shi)驗後(hou)立(li)即上(shang)機(ji)檢測(ce)；樣本(ben)處(chu)理過(guo)程中使(shi)用的器(qi)具耗(hao)材應(ying)經(jing)過(guo)無(wu)核(he)酶處(chu)理；

3. 各區(qu)域物品均(jun)為(wei)專(zhuan)用(yong)，不(bu)得交(jiao)叉使(shi)用，以(yi)免汙(wu)染(ran)；檢(jian)測(ce)結束(shu)後(hou)，應(ying)立(li)即(ji)對工(gong)作臺(tai)清(qing)潔(jie)；

4. 吸(xi)取反應(ying)液(ye)時(shi)，應(ying)盡量(liang)避(bi)免產(chan)生(sheng)氣(qi)泡(pao)；上(shang) PCR 儀前(qian)，應(ying)註(zhu)意檢(jian)查(zha)各反應(ying)管(guan)是(shi)否蓋(gai)緊，以(yi)免液(ye)體蒸(zheng)發造成結果(guo)不(bu)準(zhun)確；

5. 試(shi)劑盒所有試劑(ji)在使(shi)用前(qian)應(ying)該(gai)在常(chang)溫(wen)下(xia)充分融化混(hun)勻，並應(ying)瞬時(shi)離心(xin)；

6. 試(shi)劑盒內(nei)所配(pei)陰性(xing)和(he)陽性(xing)對照(zhao)在第(di)壹次(ci)使(shi)用前(qian)應(ying)全(quan)部轉移至標本(ben)準(zhun)備(bei)區(qu)，並單獨(du)存放；

7. 為(wei)防(fang)止(zhi)熒(ying)光幹(gan)擾，應(ying)避(bi)免裸(luo)手(shou)直接(jie)接(jie)觸PCR反(fan)應(ying)管(guan)，並應(ying)避(bi)免在PCR反(fan)應(ying)管(guan)上(shang)進(jin)行任何(he)標記(ji)；

8. 檢(jian)測(ce)過(guo)程中使(shi)用過(guo)的吸(xi)頭，應(ying)直接(jie)打到盛(sheng)有 10%次(ci)氯酸(suan)的廢(fei)物缸內(nei)，檢測(ce)結束(shu)的PCR 反(fan)應(ying)管(guan)，切忌開(kai)蓋(gai)，並與其(qi)他(ta)廢棄(qi)物品壹同(tong)滅(mie)菌(jun)後(hou)丟(diu)棄(qi)；工(gong)作臺(tai)及(ji)各種實(shi)驗用品應(ying)定(ding)期(qi)用 10%次(ci)氯酸(suan)、75%酒(jiu)精或紫(zi)外(wai)燈(deng)進(jin)行消毒；

9. 儀器(qi)擴(kuo)增相(xiang)關(guan)參(can)數應(ying)按照(zhao)本(ben)說明(ming)書(shu)相(xiang)關要(yao)求(qiu)進(jin)行設置(zhi)；不(bu)同批號試(shi)劑不能混(hun)用(yong)；並在有效(xiao)期(qi)內(nei)使(shi)用。