豬(zhu)圓(yuan)環(huan)病(bing)毒Ⅲ型(xing)PCR檢(jian)測(ce)試(shi)劑盒(he)說(shuo)明書

通用(yong)名(ming)稱：豬(zhu)圓(yuan)環(huan)病(bing)毒Ⅲ型(xing)檢(jian)測(ce)試(shi)劑盒(he)（實(shi)時熒光PCR法）

英文名(ming)稱：Porcine Circovirus Ⅲ Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包(bao)裝規格】 25 T/盒(he) ＆ 50 T/盒(he)

【預(yu)期(qi)用(yong)途(tu)】

豬(zhu)圓(yuan)環(huan)病(bing)毒（porcine circovirus，PCV）在(zai)分類學上屬圓環(huan)病(bing)毒科圓環(huan)病(bing)毒屬(shu)，為(wei)已(yi)知(zhi)的(de)最小(xiao)的(de)動(dong)物病(bing)毒之(zhi)壹(yi)。本(ben)試(shi)劑盒(he)利用(yong)實(shi)時熒光PCR原(yuan)理，定性(xing)檢(jian)測(ce)豬(zhu)圓(yuan)環(huan)病(bing)毒Ⅲ型(xing)，對(dui)豬(zhu)圓(yuan)環(huan)病(bing)毒Ⅲ型(xing)引(yin)起的(de)豬(zhu)的(de)疫(yi)病(bing)的(de)診斷和監(jian)控具(ju)有(you)重要(yao)指(zhi)導(dao)意義。

【檢(jian)驗(yan)原理】

本(ben)試(shi)劑盒(he)針對(dui)PCVⅢ型基(ji)因(yin)組高度(du)保(bao)守區(qu)域設計(ji)特(te)異(yi)性(xing)引(yin)物和探針(zhen)，在反(fan)應(ying)體(ti)系(xi)中含(han)PCVⅢ型(xing)基(ji)因(yin)組模板的(de)情(qing)況下(xia)，PCR反(fan)應得(de)以進行(xing)並釋(shi)放熒(ying)光信號。利用(yong)儀(yi)器(qi)對(dui)PCR過程中相(xiang)應通道(dao)的(de)信號強(qiang)度(du)進行(xing)實(shi)時監(jian)測和輸(shu)出，實(shi)現(xian)檢(jian)測(ce)結果的(de)定(ding)性(xing)分析(xi)。

【主要組成(cheng)成(cheng)份(fen)】

註(zhu)：陰(yin)性(xing)對(dui)照為(wei)滅(mie)菌(jun)純(chun)水(shui)，陽性(xing)對(dui)照為(wei)含(han)PCV-III型(xing)靶(ba)基(ji)因(yin)的(de)質(zhi)粒。

【儲(chu)存條件(jian)及有(you)效(xiao)期】避光-20℃以下(xia)保(bao)存，避免反(fan)復凍(dong)融，有(you)效(xiao)期12個(ge)月(yue)。

【適(shi)用(yong)儀(yi)器(qi)】ABI 系列、Bio-Rad系(xi)列、Agilent Stratagene MX系(xi)列(lie)、Roche LightCycler 480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系(xi)列、杭(hang)州博(bo)日(ri)系(xi)列等多通道(dao)實(shi)時熒光定量(liang)PCR儀。

【樣(yang)本(ben)要求(qiu)】

1. 新鮮采集的(de)咽(yan)拭(shi)子、鼻拭(shi)子和糞便標本，並使(shi)用(yong)滅(mie)菌(jun)生(sheng)理鹽水(shui)懸(xuan)浮。

2. 標本收(shou)集後(hou)若不能(neng)立即(ji)檢(jian)測(ce)，可(ke)置(zhi)於2～8℃冷藏(zang)過(guo)夜保(bao)存；如需(xu)長(chang)期(qi)保(bao)存，標本應(ying)凍(dong)存於-20℃～-80℃。

3. 標本保(bao)存期間(jian)應避免反(fan)復凍(dong)融。

【檢(jian)驗(yan)方法】

1. 試(shi)劑準備（試(shi)劑準備區(qu)）

（1）從(cong)冰(bing)箱中取(qu)出試(shi)劑盒(he), 從(cong)試(shi)劑盒(he)中取(qu)出實(shi)驗(yan)所需試(shi)劑，充分融化混(hun)勻並瞬(shun)時離心以去除(chu)管壁(bi)附著(zhe)液(ye)體。

（2）核(he)算當次(ci)實(shi)驗(yan)所需要的(de)反(fan)應數（n），並根(gen)據(ju)如下(xia)表(biao)所示反應(ying)體系(xi)計(ji)算(suan)當次(ci)實(shi)驗(yan)所需要的(de)各(ge)種(zhong)試(shi)劑量。

n =陰(yin)性(xing)對(dui)照數（1T）+陽性(xing)對(dui)照數（1T）+誤(wu)差預(yu)留量(liang)（1T）+樣(yang)本(ben)數

（3）在(zai)無(wu)菌離心管中加(jia)入(ru)上述(shu)試(shi)劑，充分混勻後(hou)瞬時離心。按(an)照20 μL/管分裝量(liang)將(jiang)試(shi)劑分裝至PCR反(fan)應(ying)管。

（4）蓋緊(jin)PCR反(fan)應管蓋後(hou)將(jiang)PCR反(fan)應(ying)管轉移至樣(yang)本(ben)處(chu)理區(qu)。剩(sheng)余試(shi)劑放回-20℃以下(xia)冰箱(xiang)冷凍(dong)保(bao)存。

2.樣(yang)本(ben)準備（樣(yang)本(ben)處(chu)理區(qu)）

用(yong)DNA/RNA提(ti)取(qu)試(shi)劑盒(he)提取(qu)核(he)酸即(ji)可(ke)，具體操作按照其試(shi)劑盒(he)說(shuo)明書操作。

3.加(jia)樣(yang)

在上述(shu)制備好的(de)PCR反應(ying)樣(yang)本(ben)管中分別(bie)加(jia)入(ru)處(chu)理好的(de)待(dai)測標本DNA各(ge)5 μl、終體積(ji)25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻後(hou)瞬時低速離心，轉移到(dao)PCR儀器(qi)上。陰(yin)性(xing)對(dui)照和陽性(xing)對(dui)照管則各(ge)加(jia)5 μL試(shi)劑盒(he)自帶的(de)陰(yin)性(xing)對(dui)照或陽性(xing)對(dui)照品，終體(ti)積(ji)為(wei)25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻後(hou)瞬時低速離心，轉移到(dao)PCR儀器(qi)上。

4.PCR（PCR擴(kuo)增區(qu)）

（1）取(qu)樣(yang)本(ben)處(chu)理區(qu)準備好的(de)PCR反應(ying)管，放置(zhi)在(zai)實(shi)時熒光定量(liang)PCR儀樣(yang)品槽相(xiang)應位置(zhi)，並記(ji)錄(lu)放置(zhi)順序(xu)。

（2）按下(xia)表(biao)設置(zhi)儀(yi)器核(he)酸擴(kuo)增相(xiang)關參數(shu)進行(xing)PCR擴(kuo)增。

註(zhu)：ABI系列(lie)熒光PCR儀(yi)在設置(zhi)時不選ROX校(xiao)正(zheng)，設置(zhi)淬(cui)滅基(ji)團(tuan)選擇(ze)None。

【參考(kao)值(zhi)（參考(kao)範圍(wei)）】

1.試(shi)劑盒(he)有(you)效(xiao)性(xing)判(pan)定(ding)：

（1）陽性(xing)對(dui)照：有(you)典型(xing)S型擴(kuo)增曲(qu)線或Ct值(zhi)≤35。

（2）陰(yin)性(xing)對(dui)照：Ct值(zhi)＞38或無(wu)Ct值(zhi)，線形為(wei)直線或輕(qing)微(wei)斜線，無(wu)指(zhi)數(shu)增長(chang)期(qi)。

2.標本結(jie)果判(pan)定(ding)：

（1）陽性(xing)：標本檢(jian)測(ce)結果Ct值(zhi)≤35或(huo)有(you)明顯指(zhi)數(shu)增長(chang)期(qi)。

（2）可(ke)疑：標本檢(jian)測(ce)結果Ct值(zhi)在(zai)35～38範(fan)圍(wei)內。此時應對(dui)標本進行(xing)重(zhong)復檢(jian)測(ce)，如重復實(shi)驗(yan)結果Ct值(zhi)仍(reng)在35～38範(fan)圍(wei)內，有(you)明顯指(zhi)數(shu)增長(chang)期(qi)，則判(pan)定(ding)為(wei)陽性(xing)，否則(ze)為(wei)陰(yin)性(xing)。

（3）陰(yin)性(xing)：標本檢(jian)測(ce)結果Ct值(zhi)＞38或無(wu)Ct值(zhi)。

【檢(jian)驗(yan)結果的(de)解釋(shi)】

【檢(jian)驗(yan)方法的(de)局限(xian)性(xing)】

1. 當檢(jian)測(ce)樣(yang)本(ben)中被(bei)檢(jian)核(he)酸濃度(du)低於本(ben)試(shi)劑盒(he)的(de)最di檢(jian)出(chu)限shi可(ke)能(neng)會(hui)發(fa)生(sheng)假(jia)陰(yin)性(xing)的(de)結(jie)果。

2. 被(bei)檢(jian)樣(yang)本(ben)在采集、運輸(shu)、儲(chu)存以及處(chu)理過程中操作方式不(bu)當容(rong)易造(zao)成(cheng)DNA降(jiang)解而(er)產生(sheng)假(jia)陰(yin)性(xing)結果。

3. 樣(yang)本(ben)在采集、運輸(shu)、儲(chu)存以及處(chu)理過程中發(fa)生(sheng)交叉汙(wu)染，則容(rong)易得到(dao)假(jia)陽性(xing)結果。

【產品性(xing)能(neng)指(zhi)標】 產品的(de)最di檢(jian)出(chu)限為(wei)10³ Copies/mL，產品CV值(zhi)≤3%。

【註(zhu)意事(shi)項(xiang)】

1. 使(shi)用(yong)本(ben)試(shi)劑盒(he)的(de)實(shi)驗(yan)室，應嚴格按(an)照國(guo)家有(you)關部(bu)分頒(ban)布(bu)的(de)有(you)關基(ji)因(yin)擴(kuo)增檢(jian)驗(yan)實(shi)驗(yan)室管理規範進行(xing)管理；

2. 為(wei)避免RNA降(jiang)解，樣(yang)本(ben)處(chu)理過程應(ying)在(zai)0-4℃條(tiao)件(jian)下(xia)操作，且完(wan)成(cheng)實(shi)驗(yan)後(hou)立即(ji)上(shang)機檢(jian)測(ce)；樣(yang)本(ben)處(chu)理過程中使(shi)用(yong)的(de)器(qi)具耗材應經過(guo)無(wu)核(he)酶(mei)處(chu)理；

3. 各(ge)區(qu)域物品均為(wei)專(zhuan)用(yong)，不(bu)得(de)交叉使(shi)用(yong)，以免汙(wu)染；檢(jian)測(ce)結束(shu)後(hou)，應立即(ji)對(dui)工作臺清潔(jie)；

4. 吸(xi)取(qu)反應(ying)液(ye)時，應盡量避免產生(sheng)氣泡(pao)；上 PCR 儀(yi)前(qian)，應(ying)註(zhu)意檢(jian)查(zha)各(ge)反應(ying)管是(shi)否蓋緊(jin)，以免液(ye)體蒸發(fa)造(zao)成(cheng)結果不(bu)準確；

5. 試(shi)劑盒(he)所有(you)試(shi)劑在使(shi)用(yong)前(qian)應(ying)該(gai)在(zai)常溫(wen)下(xia)充分融化混(hun)勻，並應(ying)瞬(shun)時離心；

6. 試(shi)劑盒(he)內所配(pei)陰(yin)性(xing)和陽性(xing)對(dui)照在第(di)壹(yi)次(ci)使(shi)用(yong)前(qian)應(ying)全(quan)部(bu)轉移至標本準(zhun)備區(qu)，並單獨(du)存放；

7. 為(wei)防(fang)止(zhi)熒(ying)光(guang)幹(gan)擾(rao)，應避免裸(luo)手(shou)直接接觸PCR反(fan)應管，並應(ying)避免在(zai)PCR反應(ying)管上進行(xing)任何標記；

8. 檢(jian)測(ce)過程中使(shi)用(yong)過(guo)的(de)吸(xi)頭，應(ying)直接打(da)到盛(sheng)有(you) 10%次(ci)氯酸的(de)廢物缸(gang)內，檢(jian)測(ce)結束(shu)的(de)PCR 反應(ying)管，切忌(ji)開蓋，並與(yu)其(qi)他(ta)廢棄(qi)物品壹(yi)同(tong)滅菌後(hou)丟棄(qi)；工(gong)作臺及各(ge)種(zhong)實(shi)驗(yan)用(yong)品應定(ding)期(qi)用(yong) 10%次(ci)氯酸、75%酒(jiu)精(jing)或(huo)紫(zi)外(wai)燈進行(xing)消(xiao)毒；

9. 儀(yi)器(qi)擴(kuo)增相(xiang)關參數(shu)應(ying)按(an)照本說(shuo)明書相(xiang)關要(yao)求(qiu)進行(xing)設置(zhi)；不同批(pi)號試(shi)劑不能(neng)混用(yong)；並在(zai)有(you)效(xiao)期內使(shi)用(yong)。