豬支(zhi)原(yuan)體肺(fei)炎PCR檢測試(shi)劑盒說(shuo)明書

豬(zhu)支(zhi)原(yuan)體肺(fei)炎檢測試(shi)劑盒（實(shi)時熒(ying)光(guang)PCR法）說(shuo)明書

通(tong)用名(ming)稱(cheng)：豬(zhu)支(zhi)原(yuan)體肺(fei)炎檢測試(shi)劑盒（實(shi)時熒(ying)光(guang)PCR法）

英文名(ming)稱(cheng)：Mycoplasma Hyopneumoniae Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝(zhuang)規格(ge)】 25T/盒 ＆ 50T/盒

【預期(qi)用途】

豬(zhu)支(zhi)原(yuan)體肺(fei)炎(Mycoplasmalpneumoniaofswine)是(shi)由(you)豬支(zhi)原(yuan)體肺(fei)炎引(yin)起(qi)的壹(yi)種(zhong)慢(man)性、接觸(chu)性、呼(hu)吸道傳(chuan)染病(bing)，又稱豬(zhu)地(di)方(fang)流(liu)行性肺(fei)炎，我(wo)國(guo)俗稱豬(zhu)氣(qi)喘(chuan)病(bing)，主(zhu)要臨診(zhen)癥(zheng)狀(zhuang)是(shi)咳(ke)嗽和氣喘(chuan)。剖檢變化(hua)為肺(fei)的尖(jian)葉(ye)、心葉(ye)和膈(ge)葉(ye)(主(zhu)葉(ye))的(de)對(dui)稱性實(shi)變。本(ben)試劑盒利(li)用實時熒(ying)光(guang)PCR原(yuan)理，定(ding)性檢測豬支(zhi)原(yuan)體肺(fei)炎，對(dui)豬(zhu)支(zhi)原(yuan)體肺(fei)炎的診(zhen)斷(duan)及(ji)療效(xiao)評(ping)估有重(zhong)要指(zhi)導(dao)意義。

【檢驗原(yuan)理】

本(ben)試劑盒針(zhen)對(dui)豬支(zhi)原(yuan)體肺(fei)炎基(ji)因(yin)設(she)計(ji)特(te)異(yi)性引(yin)物(wu)和探(tan)針(zhen)，在(zai)反應(ying)體系(xi)中含有豬(zhu)支(zhi)原(yuan)體肺(fei)炎 DNA模板(ban)的(de)情(qing)況下，PCR反應(ying)得以進(jin)行並(bing)釋(shi)放(fang)熒光(guang)信號。利(li)用儀器(qi)對(dui)PCR過(guo)程(cheng)中(zhong)相應通(tong)道的(de)信號強(qiang)度(du)進(jin)行實時監測和輸(shu)出(chu)，實現(xian)檢測結(jie)果(guo)的定(ding)性分析(xi)。

【主(zhu)要組(zu)成成份(fen)】

註：陰性對(dui)照為滅菌(jun)純水(shui)，陽(yang)性對(dui)照為含MHP靶(ba)基(ji)因(yin)的(de)質粒。

【儲(chu)存條件(jian)及(ji)有效(xiao)期(qi)】避(bi)光(guang)-20℃以下保(bao)存，避(bi)免反復凍融(rong)，有效(xiao)期(qi)12個(ge)月。

【適(shi)用儀器(qi)】ABI 系列(lie)、Bio-Rad系列(lie)、Agilent Stratagene MX系列(lie)、Roche LightCycler 480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列(lie)、杭州(zhou)博(bo)日系(xi)列(lie)等多通(tong)道實(shi)時熒(ying)光(guang)定量(liang)PCR儀。

【樣本(ben)要求(qiu)】

1. 如(ru)使用原(yuan)始(shi)標本(ben)進行檢測。標(biao)本(ben)（血(xue)液、痰(tan)液、咽(yan)拭子(zi)、腦(nao)脊液、菌(jun)落(luo)、菌(jun)苔等）應為(wei)新鮮采集並(bing)使(shi)用雙(shuang)蒸(zheng)滅菌(jun)水(shui)或(huo)滅菌(jun)生理鹽水(shui)懸浮(fu)的原(yuan)始(shi)標本(ben)。

2. 如需在增(zeng)菌(jun)後進(jin)行PCR檢測，則(ze)應(ying)使用選(xuan)擇(ze)性增(zeng)菌(jun)液對(dui)原(yuan)始(shi)標本(ben)進行增菌(jun)。

3. 標本(ben)收集(ji)後(hou)若(ruo)不能(neng)立即檢測，可置(zhi)於(yu)2～8℃冷(leng)藏(zang)過(guo)夜(ye)保(bao)存；如(ru)需長期(qi)保(bao)存，標(biao)本(ben)應凍(dong)存於(yu)-20℃～-80℃。

【檢驗方(fang)法】

1. 試(shi)劑準備(bei)（試劑準備(bei)區）

（1）從冰(bing)箱(xiang)中取(qu)出(chu)試劑盒, 從試(shi)劑盒中(zhong)取(qu)出(chu)實驗所(suo)需試劑，充分融(rong)化(hua)混勻(yun)並(bing)瞬(shun)時離(li)心(xin)以去除管壁附著液體(ti)。

（2）核算(suan)當(dang)次(ci)實驗所(suo)需要的(de)反應(ying)數（n），並(bing)根(gen)據如下表所(suo)示反應(ying)體系(xi)計算(suan)當(dang)次(ci)實驗所(suo)需要的(de)各(ge)種(zhong)試(shi)劑量。

n =陰(yin)性對(dui)照數（1T）+陽(yang)性對(dui)照數（1T）+誤(wu)差預留(liu)量（1T）+樣本(ben)數

（3）在無菌(jun)離心(xin)管中加(jia)入(ru)上(shang)述(shu)試劑，充分混(hun)勻(yun)後瞬(shun)時離(li)心(xin)。按照20 μL/管分裝(zhuang)量(liang)將(jiang)試劑分裝(zhuang)至(zhi)PCR反應(ying)管。

（4）蓋緊PCR反應(ying)管蓋後將(jiang)PCR反應(ying)管轉移(yi)至樣本(ben)處理區(qu)。 剩余(yu)試劑放(fang)回-20℃以下冰箱(xiang)冷(leng)凍(dong)保(bao)存。

2.樣本(ben)準備(bei)（樣本(ben)處理區(qu)）

用DNA/RNA提(ti)取試(shi)劑盒提(ti)取核(he)酸即可，具體操(cao)作按照其試劑盒說(shuo)明書操作(zuo)。

3.加(jia)樣

在上述(shu)制備(bei)好(hao)的(de)PCR反應(ying)樣本(ben)管中分別(bie)加(jia)入(ru)處(chu)理好(hao)的(de)待(dai)測標(biao)本(ben)DNA各(ge)5μl、終體積25μl/管，蓋好(hao)PCR反應(ying)蓋混勻(yun)後(hou)瞬時低速離(li)心(xin)，轉移(yi)到(dao)PCR儀器(qi)上(shang)。陰性對(dui)照和陽(yang)性對(dui)照管則各(ge)加(jia)5μL試(shi)劑盒自(zi)帶的陰(yin)性對(dui)照或(huo)陽(yang)性對(dui)照品，終體積為(wei)25μl/管，蓋好(hao)PCR反應(ying)蓋混勻(yun)後(hou)瞬時低速離(li)心(xin)，轉移(yi)到(dao)PCR儀器(qi)上(shang)。

4.PCR（PCR擴(kuo)增區(qu)）

（1）取(qu)樣本(ben)處理區(qu)準(zhun)備(bei)好(hao)的(de)PCR反應(ying)管，放(fang)置在實(shi)時熒(ying)光(guang)定量(liang)PCR儀樣品槽相應位(wei)置，並(bing)記(ji)錄(lu)放(fang)置順(shun)序(xu)。

（2）按下表設(she)置(zhi)儀器(qi)核(he)酸擴(kuo)增相關(guan)參(can)數進行PCR擴增。

註：ABI系列(lie)熒光(guang)PCR儀在(zai)設(she)置(zhi)時不(bu)選(xuan)ROX校(xiao)正，設(she)置(zhi)淬滅基(ji)團選(xuan)擇(ze)None。

【參(can)考值（參(can)考範(fan)圍(wei)）】

1.試(shi)劑盒有效(xiao)性判(pan)定：

（1）陽(yang)性對(dui)照：有典(dian)型(xing)S型(xing)擴(kuo)增(zeng)曲(qu)線或(huo)Ct值≤35。

（2）陰性對(dui)照：Ct值＞38或(huo)無Ct值，線形(xing)為(wei)直線或(huo)輕(qing)微斜(xie)線，無指數(shu)增(zeng)長期(qi)。

2.標(biao)本(ben)結果(guo)判(pan)定(ding)：

（1）陽(yang)性：標(biao)本(ben)檢測結(jie)果(guo)Ct值≤35或(huo)有明顯指數增長期(qi)。

（2）可(ke)疑：標本(ben)檢測結(jie)果(guo)Ct值在35～38範(fan)圍(wei)內。此時應(ying)對(dui)標本(ben)進行重(zhong)復檢測，如(ru)重(zhong)復實驗結果Ct值仍(reng)在(zai)35～38範(fan)圍(wei)內，有明顯指數增長期(qi)，則判(pan)定為(wei)陽(yang)性，否(fou)則為陰(yin)性。

（3）陰性：標(biao)本(ben)檢測結(jie)果(guo)Ct值＞38或(huo)無Ct值。

【檢驗結果的解釋(shi)】

【檢驗方(fang)法的局(ju)限性】

1. 當(dang)檢測樣本(ben)中被(bei)檢核酸(suan)濃度(du)低於(yu)本(ben)試劑盒的(de)最(zui)di檢出(chu)限shi可(ke)能(neng)會(hui)發生(sheng)假陰性的(de)結果。

2. 被(bei)檢樣本(ben)在采集、運輸(shu)、儲(chu)存以及(ji)處(chu)理過(guo)程(cheng)中(zhong)操作(zuo)方(fang)式(shi)不(bu)當(dang)容(rong)易(yi)造(zao)成DNA降(jiang)解而(er)產生(sheng)假陰(yin)性結(jie)果。

3. 樣本(ben)在采集、運輸(shu)、儲(chu)存以及(ji)處(chu)理過(guo)程(cheng)中(zhong)發生(sheng)交(jiao)叉汙染，則(ze)容(rong)易(yi)得(de)到(dao)假陽(yang)性結(jie)果。

【產品性能(neng)指標】 產(chan)品的最(zui)di檢出(chu)限為(wei)10³Copies/mL，產品CV值≤3%。

【註意事(shi)項】

1. 使用本(ben)試劑盒的(de)實(shi)驗室(shi)，應嚴(yan)格(ge)按照國(guo)家有關(guan)部分頒布的有關(guan)基(ji)因(yin)擴(kuo)增檢驗實驗室(shi)管理規範(fan)進行管理；

2. 為(wei)避(bi)免RNA降解，樣本(ben)處理過(guo)程(cheng)應(ying)在0-4℃條件(jian)下操作(zuo)，且(qie)完(wan)成實驗後立即上(shang)機檢測；樣本(ben)處理過(guo)程(cheng)中(zhong)使用的(de)器(qi)具耗材應經(jing)過(guo)無核酶(mei)處(chu)理；

3. 各(ge)區域(yu)物(wu)品均為專(zhuan)用，不(bu)得(de)交叉使用，以免汙染；檢測結(jie)束(shu)後，應(ying)立即對(dui)工作(zuo)臺(tai)清(qing)潔；

4. 吸取反應(ying)液時，應(ying)盡(jin)量避(bi)免產生(sheng)氣泡(pao)；上(shang) PCR 儀前，應註意檢查各(ge)反應(ying)管是(shi)否(fou)蓋緊，以免液體(ti)蒸發造成結果不(bu)準(zhun)確(que)；

5. 試劑盒所(suo)有試(shi)劑在使(shi)用前應該在常(chang)溫(wen)下充分融(rong)化(hua)混勻(yun)，並(bing)應(ying)瞬時離(li)心；

6. 試(shi)劑盒內所(suo)配陰(yin)性和陽(yang)性對(dui)照在第壹(yi)次(ci)使用前應全部轉(zhuan)移(yi)至標(biao)本(ben)準備(bei)區，並(bing)單獨存放(fang)；

7. 為(wei)防止熒(ying)光(guang)幹擾(rao)，應避(bi)免裸手(shou)直接接觸(chu)PCR反應(ying)管，並(bing)應(ying)避(bi)免在PCR反應(ying)管上進行任(ren)何標記(ji)；

8. 檢測過(guo)程(cheng)中(zhong)使用過(guo)的(de)吸頭(tou)，應直接打到(dao)盛有 10%次(ci)氯(lv)酸的(de)廢(fei)物(wu)缸(gang)內，檢測結(jie)束(shu)的PCR 反應(ying)管，切忌開蓋，並(bing)與其(qi)他廢棄(qi)物(wu)品壹(yi)同滅菌(jun)後丟(diu)棄(qi)；工(gong)作臺(tai)及各(ge)種(zhong)實(shi)驗用品應定(ding)期(qi)用 10%次(ci)氯(lv)酸、75%酒(jiu)精或(huo)紫(zi)外(wai)燈(deng)進行消毒；

9. 儀器(qi)擴(kuo)增相關(guan)參(can)數應按照本(ben)說(shuo)明書相關(guan)要求(qiu)進(jin)行設(she)置(zhi)；不(bu)同(tong)批(pi)號(hao)試(shi)劑不能(neng)混(hun)用；並(bing)在(zai)有效(xiao)期(qi)內使(shi)用。