安定(ding)快速(su)ELISA檢測(ce)試劑盒簡(jian)介(jie)

                                          安定(ding)快速(su)ELISA檢測(ce)試劑盒

使(shi)用(yong)說明(ming)書

【原(yuan)理(li)】

本(ben)試(shi)劑盒采用(yong)間接(jie)競爭(zheng)ELISA方(fang)法，在(zai)微孔(kong)條上(shang)預(yu)包(bao)被(bei)偶(ou)聯抗原(yuan)，樣本(ben)中的殘留物(wu)安定(ding)和(he)微孔(kong)條上(shang)預(yu)包(bao)被(bei)的偶(ou)聯(lian)抗原(yuan)競爭(zheng)安定(ding)抗體，加入(ru)酶(mei)標(biao)記(ji)物(wu)後，用(yong)TMB底(di)物(wu)顯色，樣本(ben)吸(xi)光值與其(qi)所含(han)殘留物(wu)安定(ding)的含(han)量成負相(xiang)關(guan)，與標(biao)準曲線比較可得(de)出相(xiang)應(ying)殘留物(wu)安定(ding)的含(han)量。

【試(shi)劑盒技(ji)術指標(biao)】   

規(gui)       格(ge)：96孔(kong)/盒

靈(ling) 敏(min) 度(du)： 0.05ppb

檢測(ce)時間(jian)： 45min

樣本(ben)定(ding)量(liang)檢測(ce)下(xia)限

組織(zhi)（蝦、魚(yu)）……………………………………0.05ppb

豬肉(rou)/肝 雞肉(rou)/肝 …………………………………… 0.5ppb

飼(si)料………………………………………………… 10ppb

尿液…………………………………………………0.3ppb

反(fan)應(ying)率(lv)

安定(ding)………………………………………………100%

樣本(ben)回(hui)收(shou)率(lv)

飼(si)  料……………………………………………90±10%

組  織(zhi)……………………………………………85±10%

尿  液……………………………………………70±10%

【試(shi)劑盒組成】   

1、微量(liang)測(ce)試孔(kong)：每條8孔(kong)，壹板12條(tiao)

2、標(biao)準液×6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.05 ppb、 0.15 ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05 ppb

3、高(gao)濃(nong)度(du)標準品×1瓶：（1ml/瓶）100ppb

4、酶(mei)標(biao)記(ji)物(wu)        7ml………………………………紅(hong)色帽

5、抗體工(gong)作液    7ml………………………………綠色帽

6、底(di)物(wu)液 A液   7ml………………………………棕色帽

7、底(di)物(wu)液 B液   7ml……………………………… 黑色帽

8、終(zhong) 止(zhi) 液         7ml……………………………… 黃(huang)色帽

9、20X濃(nong)縮(suo)洗(xi)滌(di)液  40ml…………………………白(bai)色帽

10、2X濃(nong)縮(suo)復(fu)溶(rong)液   50ml…………………………藍色帽

【所用(yong)儀器(qi)、試(shi)劑】   

儀器(qi)：微孔(kong)板酶(mei)標(biao)儀450nm/630nm、旋(xuan)轉(zhuan)蒸發儀/氮(dan)氣(qi)吹幹(gan)裝置、均(jun)質器(qi)、振蕩(dang)器(qi)、離(li)心機(ji)、刻(ke)度移(yi)液管(guan)、天平(ping)（感(gan)量(liang)0.01g ）

微量(liang)移液器(qi)：單(dan)道 20µl～200µl、100µl～1000µl、多(duo)道 250µl

試(shi)   劑：乙(yi)腈(jing)、氫(qing)氧(yang)化鈉、氯(lv)仿(fang)、丙酮(tong)、濃(nong)磷酸(suan)（含(han)量85%）

              乙(yi)酸(suan)乙(yi)酯、正己(ji)烷

【實(shi)驗前(qian)溶液配制(zhi)】

配液1、將(jiang)1X濃(nong)縮(suo)復(fu)溶(rong)液用(yong)去離(li)子水按(an)照(zhao)1：1稀釋(shi)（1份(fen)濃(nong)縮(suo)復(fu)溶(rong)液+1份(fen)去(qu)離(li)子(zi)水(shui)）用(yong)於(yu)樣本(ben)的復(fu)溶(rong)。

配液2、將(jiang)40ml濃(nong)縮(suo)洗(xi)滌(di)液（20倍濃(nong)縮(suo)）用(yong)去離(li)子水按(an)照(zhao)1：19

稀釋(shi)（1份(fen)濃(nong)縮(suo)洗(xi)滌(di)液+19份(fen)去(qu)離(li)子(zi)水(shui)），或按(an)所需用(yong)量配制(zhi)洗(xi)滌(di)液。

【樣本(ben)前(qian)處理(li)步(bu)驟(zhou)】   

處(chu)理(li)任(ren)何樣本(ben)時，都(dou)必(bi)須(xu)註(zhu)意：

（1）實(shi)驗中必須(xu)使(shi)用(yong)壹次性吸(xi)頭(tou)，在(zai)吸(xi)取不(bu)同(tong)的試(shi)劑時要(yao)更換(huan)吸(xi)頭(tou)。

（2）實(shi)驗之前(qian)須檢查(zha)各(ge)種實驗(yan)器(qi)具(ju)是否幹凈，必(bi)要時可(ke)對(dui)實(shi)驗器(qi)具(ju)進(jin)行清潔，以(yi)避免汙染幹擾(rao)實(shi)驗結(jie)果(guo)。

（a）飼(si)料樣本(ben)

1、 稱(cheng)取2±0.05g搗(dao)粹後(hou)的飼(si)料樣本(ben)，加入(ru)8ml乙(yi)腈(jing)，振搖5min，15℃，4000r/min以(yi)上(shang)，離(li)心10min；

2、 取2ml上(shang)清液，60℃氮(dan)氣(qi)/空(kong)氣(qi)吹幹(gan)；

3、 加入(ru)0.5ml氯(lv)仿(fang)，渦動(dong)20s，加入(ru)2ml 1M NaOH，渦動(dong)30s，4000r/min以(yi)上(shang)，離(li)心5min；

4、 取1ml上(shang)清液，加入(ru)100µl 6M H₃PO₄，渦動(dong)5s；

不(bu)同樣本(ben)按(an)如(ru)下(xia)方(fang)法(fa)稀釋(shi)：

配合(he)料：取50µl，加入(ru)950µl稀釋(shi)後(hou)的復(fu)溶(rong)液，渦動(dong)混(hun)勻30s，取50µl 用(yong)於(yu)檢測(ce)。（配合(he)料稀釋(shi)倍數：100）

濃(nong)縮(suo)料/預(yu)混(hun)料：取25µl，加入(ru)975µl稀釋(shi)後(hou)的復(fu)溶(rong)液，渦動(dong) 混(hun)勻30s，取50µl 用(yong)於(yu)檢測(ce)。（濃(nong)縮(suo)料、預(yu)混(hun)料稀釋(shi)倍數：200  ）

（b）組織(zhi)（雞肉(rou)/肝、豬肉(rou)/肝、蝦、魚(yu)）

1、 用(yong)均質(zhi)器(qi)均(jun)質組織(zhi)樣本(ben)；

2、 稱(cheng)3±0.05g樣本(ben)於(yu)離(li)心(xin)管(guan)中，先加入(ru)3ml去(qu)離子(zi)水(shui)充(chong)分(fen)混(hun)勻再(zai)加入(ru)6ml乙(yi)酸(suan)乙(yi)酯，振蕩(dang)5min，室(shi)溫(wen)4000r/min以(yi)上(shang)，離心(xin)10min；

3、 取出4ml上(shang)層液體在(zai)氮(dan)氣(qi)流50-60℃水(shui)浴中幹燥(zao)；

4、 加入(ru)1ml稀釋(shi)後(hou)的復(fu)溶(rong)液強(qiang)烈振蕩(dang)混合(he)30s，再(zai)加入(ru)1 ml正(zheng)己烷溶解(jie)幹(gan)燥(zao)的殘留物(wu)室(shi)溫(wen)4000r/min以(yi)上(shang)離心(xin)5min。

5、 取50 µl下(xia)層(ceng)相(xiang)用(yong)於(yu)分(fen)析(xi)。

樣本(ben)稀釋(shi)倍數：0.5     

不(bu)同樣本(ben)按(an)如(ru)下(xia)方(fang)法(fa)稀釋(shi)：

        蝦魚(yu)：直接(jie)取50µl水(shui)相(xiang)用(yong)於(yu)檢測(ce)。

        豬肉(rou)/肝、雞肉(rou)/肝：取50µl水(shui)相(xiang)加入(ru)450µl稀釋(shi)後(hou)

       的復(fu)溶(rong)液，渦動(dong)混(hun)合(he)30s；取50µl用(yong)於(yu)檢測(ce)。

       蝦魚(yu)稀釋(shi)倍數：0.5      

       豬肉(rou)/肝、雞肉(rou)/肝稀釋(shi)倍數：5

（c）尿液

1、 取2ml尿液到(dao)離(li)心管(guan)中，室(shi)溫(wen)4000r/min以(yi)上(shang)，離(li)心10min，直(zhi)至清(qing)亮(liang)；

2、 移(yi)取1ml清(qing)亮(liang)尿液至(zhi)離心管(guan)中，加入(ru)1ml　1M NaOH強(qiang)烈振蕩(dang)5min；

3、 加入(ru)100µl  6M H₃PO₄，渦動(dong)30 s；

4、 再(zai)加入(ru)8ml氯(lv)仿(fang)進(jin)行萃取，振蕩(dang)5min。15℃，4000r/min以(yi)上(shang)，離(li)心10min；

5、 去(qu)掉(diao)上(shang)層的水(shui)相(xiang)，取下(xia)層(ceng)有(you)機相(xiang)4 ml，60℃氮(dan)氣(qi)/空(kong)氣(qi)吹幹(gan)；

6、 用(yong)3ml稀釋(shi)後(hou)的復(fu)溶(rong)液幹(gan)燥(zao)的殘留物(wu)，混(hun)合(he)30s；

取50µl 用(yong)於(yu)檢測(ce)。

樣本(ben)稀釋(shi)倍數：6

【酶(mei)標(biao)免(mian)疫(yi)分(fen)析(xi)程(cheng)序(xu)】   

操(cao)作(zuo)步(bu)驟(zhou)：

1、 從(cong)4℃冷(leng)藏(zang)環境(jing)中取出所需試劑，置室(shi) 溫(wen)（20-25℃）平(ping)衡30min以(yi)上(shang)，註(zhu)意每種液體試(shi)劑使(shi)用(yong)前(qian)均須搖勻。

2、 取出框(kuang)架及(ji)需要(yao)數量(liang)的微孔(kong)，將不用(yong)的微孔(kong)放(fang)入(ru)自(zi)封袋，保存(cun)於(yu)2-8℃。

3、 編(bian)號(hao)：將(jiang)樣本(ben)和(he)標(biao)準品對(dui)應(ying)微孔(kong)按序編(bian)號(hao)，每個樣本(ben)和(he)標(biao)準品做(zuo)2孔(kong)平行，並(bing)記(ji)錄(lu)標準孔和(he)樣本(ben)孔(kong)所在(zai)的位置。

4、 加標(biao)準品/樣本(ben) 50µl/孔(kong)到(dao)各(ge)自(zi)的微孔(kong)中，加入(ru)酶(mei)標(biao)記(ji)物(wu)50µl/孔(kong),然後(hou)加入(ru)抗體50µl/孔(kong)，用(yong)蓋(gai)板膜(mo)封板，輕(qing)輕(qing)震蕩(dang)混勻。25℃環(huan)境(jing)中反應(ying)30min。

5、 取出將(jiang)孔(kong)內液體甩(shuai)幹，用(yong)洗液250µl /孔(kong)，洗板(ban)4－5次(ci)，每次間(jian)隔15-30s，用(yong)吸水(shui)紙(zhi)拍幹（拍幹後未被(bei)清(qing)除的氣(qi)泡(pao)可用(yong)幹凈的槍(qiang)頭(tou)刺(ci)破）。

6、 顯(xian)色：每孔加入(ru)底(di)物(wu)液A液50µl， 再(zai)加B液50µl，輕(qing)輕(qing)振蕩(dang)混勻，25℃環(huan)境(jing)中避光顯色15min。

7、 測(ce)定：每孔加入(ru)終止(zhi)液50µl，輕(qing)輕(qing)振蕩(dang)混勻，設(she)定(ding)酶(mei)標(biao)儀於(yu)450nm處(chu)（建議(yi)用(yong)雙(shuang)波長(chang)450/630nm檢測(ce)，在(zai)5min內(nei)讀完(wan)數據），測(ce)定每孔OD值(zhi)。

【結(jie)果(guo)判(pan)定】   

結(jie)果(guo)判(pan)定有(you)兩種(zhong)方法(fa)，粗(cu)略判(pan)定可(ke)用(yong)第(di)1種(zhong)方法(fa)，定(ding)量(liang)判(pan)定用(yong)第(di)2種(zhong)方法(fa)。註(zhu)意樣本(ben)吸(xi)光值與其(qi)所含(han)安定(ding)成(cheng)負相(xiang)關(guan)。

1、粗(cu)略判(pan)定

用(yong)樣本(ben)的平(ping)均(jun)吸光度值與標(biao)準吸(xi)光度值(zhi)比較即可得(de)出其(qi)濃度範(fan)圍(ppb)。假設(she)樣本(ben)1的吸(xi)光度值為0.310， 樣本(ben)2的吸(xi)光度值為0.820，標(biao)準液吸(xi)光度值分別是(shi)：0ppb為(wei)1.510;0.05ppb為(wei)1.320；0.15ppb為(wei)1.030；0.45ppb為(wei)0.660； 1.35ppb為(wei)0.389；4.05ppb為(wei)0.198。則(ze)樣本(ben)1的濃(nong)度(du)範圍是1.35ppb-4.05ppb； 樣本(ben)2的濃(nong)度(du)範圍是0.15 ppb-0.45 ppb。乘(cheng)以(yi)其(qi)對(dui)應(ying)的稀釋(shi)倍數即為樣本(ben)中安定(ding)實(shi)際(ji)含(han)量。

2、定(ding)量分(fen)析(xi)

（1）百(bai)分(fen)吸(xi)光率的計算，標(biao)準品或樣本(ben)的百(bai)分(fen)吸(xi)光率等於(yu)標(biao)準品或樣本(ben)的百(bai)分(fen)吸(xi)光度值的平(ping)均(jun)值（雙(shuang)孔）除以(yi)第(di)壹個標準（0標(biao)準）的吸(xi)光度值，再乘(cheng)以(yi)100%，即：

B—標(biao)準溶液或樣本(ben)溶(rong)液的平(ping)均(jun)吸光度值

B₀—0ng/ml標(biao)準溶液的平(ping)均(jun)吸光度值

（2）標(biao)準曲線的繪制(zhi)與(yu)計算

以(yi)標準品百(bai)分(fen)吸(xi)光率為縱坐(zuo)標，以(yi)安定(ding)濃(nong)度（ng /ml）的半(ban)對(dui)數為(wei)橫(heng)坐標(biao)，繪制(zhi)標(biao)準曲線圖。將樣本(ben)的百(bai)分(fen)吸(xi)光率代入(ru)標準曲線中，從(cong)標準曲線上(shang)讀出樣本(ben)所對(dui)應(ying)的濃(nong)度(du)，乘以(yi)其(qi)對(dui)應(ying)的稀釋(shi)倍數即為樣本(ben)中安定(ding)實(shi)際(ji)含(han)量。

若(ruo)利用(yong)試劑盒專業(ye)分析(xi)軟(ruan)件(jian)進(jin)行計算，更(geng)便(bian)於(yu)大量樣本(ben)的準確、快速(su)分析(xi)。（歡(huan)迎(ying)來電索取）   

3、標(biao)準曲線

B/B0 (%)

        0.05       0.15        0.45        1.35       4.05

                                    安定(ding)(ppb) [µg/kg]

                         圖(tu)1：安定(ding)檢測(ce)試劑盒的回(hui)歸(gui)曲線

4、再(zai)現性(xing)

%CV 

            0     0.05    0.15     0.45      1.35    4.05

                              安定(ding)(ppb) [µg/kg]

                圖(tu)2：安定(ding)檢測(ce)試劑盒的精(jing)密(mi)度

由(you)多(duo)個不同(tong)的實(shi)驗(yan)結(jie)果(guo)確定了(le)精(jing)密(mi)度，圖2顯(xian)示出安定(ding)檢測(ce)試劑盒的精(jing)密(mi)度情況(kuang)，獲(huo)得(de)的標(biao)準吸收(shou)值(zhi)的變(bian)異(yi)系數（%CV）對(dui)相(xiang)應(ying)安定(ding)濃(nong)度作(zuo)曲線，可以(yi)看到(dao)在(zai)全(quan)部(bu)範(fan)圍內變(bian)異(yi)系數如(ru)此之低，可(ke)以(yi)得(de)到(dao)很(hen)好的再(zai)現(xian)性。

【註(zhu)意事(shi)項(xiang)】

1、 使(shi)用(yong)前(qian)將所有(you)試劑溫(wen)度回(hui)升(sheng)至(zhi)室(shi)溫(wen)20-25℃。試(shi)劑及(ji)標本(ben)沒(mei)有(you)回(hui)到(dao)室(shi)溫(wen)（20-25℃）會(hui)導致(zhi)所有(you)標準的OD值(zhi)偏(pian)低。

2、 在(zai)洗(xi)板過(guo)程(cheng)中如(ru)果(guo)出現(xian)板(ban)孔幹燥(zao)的情(qing)況(kuang)，則會(hui)伴(ban)隨(sui)著出現(xian)標(biao)準曲線不成線性，重(zhong)復(fu)性(xing)不(bu)好的現(xian)象(xiang)。所以(yi)洗板(ban)拍(pai)幹(gan)後應(ying)立(li)即進(jin)行下(xia)壹步(bu)操(cao)作(zuo)。

3、 混(hun)合(he)要(yao)均(jun)勻，否則會(hui)出現(xian)重(zhong)復(fu)性(xing)不(bu)好的現(xian)象(xiang)。

4、 反(fan)應(ying)終(zhong)止(zhi)液為(wei)2M硫(liu)酸(suan)，避免接(jie)觸(chu)皮(pi)膚(fu)。

5、 不(bu)要使(shi)用(yong)過(guo)了(le)有(you)效日(ri)期(qi)的試(shi)劑盒，稀釋(shi)或攙(chan)雜使(shi)用(yong)會(hui)引起靈(ling)敏(min)度、OD值(zhi)的變(bian)化。不(bu)要(yao)交(jiao)換(huan)使(shi)用(yong)不同(tong)批號(hao)的盒中試劑。

6、 不(bu)用(yong)的微孔(kong)板放(fang)進(jin)自(zi)封袋密封；標準物(wu)質和(he)無(wu)色的發色劑對(dui)光敏(min)感(gan)，因(yin)此要避免直(zhi)接(jie)暴露(lu)在(zai)光線下(xia)。

7、 顯(xian)色液若(ruo)有(you)任何(he)顏(yan)色表明變(bian)質，應(ying)當(dang)棄(qi)之。0標(biao)準的吸(xi)光度值小於(yu)0.5個單(dan)位（A_450nm< 0.5 ）時，表示試劑可(ke)能變質(zhi)。

8、 該(gai)試劑盒最佳(jia)反應(ying)溫(wen)度(du)為(wei)25℃，溫(wen)度過(guo)高(gao)或過(guo)低將(jiang)導致(zhi)檢測(ce)吸光度值和(he)靈(ling)敏(min)度發生變(bian)化。

【儲(chu)存】原(yuan)包裝(zhuang)應(ying)儲(chu)存(cun)於(yu)2～8℃保(bao)鮮冷(leng)藏(zang)，切(qie)勿冷凍(dong)。

【有(you)效期】有(you)效期12個月;生產日(ri)期(qi)、有(you)效期、批號(hao)見(jian)外包(bao)裝。