呋喃妥(tuo)因代謝(xie)物(wu)ELISA檢測(ce)試劑盒簡介

                      呋喃妥(tuo)因代謝(xie)物(wu)ELISA檢測(ce)試劑盒

（尿(niao)樣專用）使(shi)用說(shuo)明(ming)書(shu)

【產品(pin)簡介】

硝基(ji)呋喃類藥物(wu)因有(you)非常(chang)好(hao)的抗(kang)菌作用和藥(yao)動力(li)學(xue)的特(te)性(xing)，曾經被廣(guang)泛(fan)應用，作(zuo)為(wei)禽類、水產和豬促(cu)生(sheng)長的添加(jia)劑。呋喃妥(tuo)因在1995年(nian)被禁用。由(you)於硝基(ji)呋喃類藥物(wu)在體(ti)內很(hen)快(kuai)就能被代謝(xie)，而在組織(zhi)中(zhong)結(jie)合(he)的代謝(xie)產物(wu)則能(neng)存留(liu)較長(chang)的壹(yi)段時間(jian)，所以(yi)管(guan)理(li)部門就以(yi)檢測(ce)代謝(xie)產物(wu)為(wei)手(shou)段達(da)到檢測(ce)硝(xiao)基呋喃類殘(can)留(liu)的目的。

呋喃妥(tuo)因代謝(xie)物(wu)快速(su)檢測(ce)試劑盒具有(you)方便、快(kuai)速(su)、靈敏等特(te)點(dian)，適(shi)用於動物尿液大批(pi)量(liang)樣品中的呋喃妥(tuo)因代謝(xie)物(wu)快速(su)檢測(ce)。

【測(ce)定原理(li)】

本試劑盒采用間(jian)接(jie)競爭ELISA方法檢測(ce)水產和雞(ji)肉(rou)等組織(zhi)樣本中(zhong)的AHD，在微孔條上(shang)預(yu)包被上(shang)偶聯(lian)抗原(yuan)，利用抗(kang)原(yuan)與(yu)抗(kang)體(ti)的特(te)異性(xing)免疫(yi)化學反應的原(yuan)理(li)來(lai)進(jin)行的，樣本中(zhong)的AHD和微孔條上(shang)預(yu)包被偶聯(lian)抗原(yuan)競爭抗呋喃妥(tuo)因代謝(xie)物(wu)的衍(yan)生(sheng)物抗(kang)體，加(jia)入(ru)酶標記(ji)物後，用TMB底(di)物(wu)顯色，樣品中(zhong)的AHD含量(liang)與(yu)樣品的吸(xi)光(guang)度(du)值呈(cheng)反比，與(yu)標準曲(qu)線比較即(ji)可(ke)得(de)出(chu)呋喃妥(tuo)因代謝(xie)物(wu)含量(liang)。

【試劑盒技(ji)術指(zhi)標】   

規       格(ge)：96孔/盒

靈 敏 度： 0.05ppb

檢測(ce)時(shi)間： 45min

樣本檢測(ce)下(xia)限：

蜂(feng)蜜……………………………………… 0.3ppb

參考(kao)標準GB/T 21311-2007 檢測(ce)下(xia)限為(wei)0.5ppb

交(jiao)叉反應率：

呋喃妥(tuo)因代謝(xie)物(wu)……………………………… 100%

呋喃西林(lin)代謝(xie)物(wu)………………………………﹤0.1%

呋喃它酮(tong)代謝(xie)物(wu)………………………………﹤0.1%

呋喃唑酮代謝(xie)物(wu)………………………………﹤0.1%

回(hui)收率(lv)：

組織、肝臟(zang)………………………………90%±15%

蜂(feng)蜜、牛奶(nai)、腸(chang)衣………………………80%±15%

【試劑盒組成(cheng)】   

1、 微量測(ce)試孔(kong)：1×96孔板（12條×8孔）

2、 標準液×6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb

3、 高(gao)濃(nong)度標準品(pin)×1瓶：（1ml/瓶(ping)）100ppb

4、 酶標記(ji)物      7ml………………… 紅(hong)色帽

5、 抗體(ti)工(gong)作液  7ml………………… 藍色帽

6、 底(di)物(wu)A液     7 ml………………… 棕(zong)色帽

7、 底(di)物(wu)B液     7 ml ………………… 黑色帽

8、 終止(zhi)液     　7 ml ………………… 黃(huang)色帽

9、 20×濃縮(suo)洗(xi)滌液40 ml…………… 白色帽

10、 2×濃縮(suo)復溶(rong)液 50 ml …………… 藍色帽

11、 衍生(sheng)化試劑　 10ml ………………黑色帽

【所用儀(yi)器、試劑】   

具備的儀(yi)器：微孔酶標儀(yi)、打(da)印(yin)機、均質(zhi)器 、氮(dan)氣吹(chui)幹裝置(zhi)、振蕩(dang)器(qi)、離心機、刻(ke)度移液管(guan)、天平（感量(liang)0.01g）

微量移液器：單(dan)道(dao)20µl-200µl，100µl-1000µl、 多道250µl

試          劑：氫氧(yang)化鈉、乙酸乙酯、正(zheng)己烷(wan)、磷(lin)酸氫(qing)二鉀(jia)、濃HCl

【實(shi)驗(yan)前溶(rong)液配制】

配液1、將2×濃縮(suo)復溶(rong)液用去(qu)離(li)子水按照1：1稀釋(shi)（1 份(fen)濃縮(suo)復溶(rong)液+1份(fen)去離(li)子水）用於樣本的復溶(rong)。

配液2、將40ml濃縮(suo)洗(xi)滌液（20倍(bei)濃(nong)縮）用去(qu)離(li)子水按照 1：19稀釋(shi)（1份(fen)濃縮(suo)洗滌(di)液+19份(fen)去離(li)子水），或按(an)所需用量(liang)配制洗(xi)滌(di)液。

配液3、 0.1MK₂HPO₄  稱11.4g K₂HPO₄·3H₂O

加(jia)去(qu)離(li)子水溶(rong)解(jie)定容至(zhi)500ml。

配液4、1M HCl溶(rong)液

取8.6ml濃HCl加(jia)去(qu)離(li)子水定溶(rong)至100ml。

配液5、1M NaOH溶(rong)液

               取4g NaOH加(jia)去(qu)離(li)子水定容至(zhi)100ml。

【樣本前(qian)處理(li)方法】   

樣本處(chu)理(li)前須(xu)知(zhi)

（1）本試劑盒所檢測(ce)的組織(zhi)樣本包(bao)括：動物組織(zhi)、禽類和水產組織(zhi)。eg:雞、鴨(ya)、豬、牛、羊(yang)、兔、魚、蝦等。

（2）實(shi)驗(yan)中必(bi)須(xu)使(shi)用壹(yi)次性(xing)吸頭(tou)，在吸(xi)取(qu)不同的試劑時(shi)要更換(huan)吸頭(tou)。

（3）實(shi)驗(yan)前須(xu)檢查各種(zhong)實(shi)驗(yan)器具是否(fou)幹凈(jing)，必(bi)要時對(dui)實(shi)驗(yan)器具進(jin)行清(qing)潔，以(yi)避免汙染(ran)幹擾實(shi)驗(yan)結果(guo)。

樣本前(qian)處理(li)步(bu)驟(zhou)：

該方法為(wei)氯(lv)黴(mei)素(su)和硝(xiao)基(ji)呋喃類四項同時(shi)檢測(ce)的五(wu)合壹前(qian)處(chu)理(li)方法；用本(ben)方法制備出(chu)的樣品提取溶(rong)液可(ke)以(yi)直接(jie)同時(shi)應用於本公(gong)司(si)研(yan)發的氯(lv)黴(mei)素(su)和呋喃唑酮代謝(xie)物(wu)、呋喃妥(tuo)因代謝(xie)物(wu)、呋喃妥(tuo)因代謝(xie)物(wu)、呋喃西林(lin)代謝(xie)物(wu)檢測(ce)試劑盒。(備註(zhu)：使(shi)用該(gai)五(wu)合(he)壹(yi)前(qian)處(chu)理(li)方法檢測(ce)氯(lv)黴(mei)素(su)時(shi)，因(yin)存在(zai)壹(yi)定的幹擾；樣本檢測(ce)下(xia)限為(wei)0.3ppb）

(a) 尿樣（樣本稀(xi)釋倍(bei)數(shu)：1）

1. 尿樣必(bi)須(xu)收(shou)集新鮮清(qing)亮樣品（如尿樣渾(hun)濁可(ke)以(yi)進(jin)行過濾或離(li)心10min，4000r/min，直至(zhi)得(de)到清(qing)亮尿(niao)樣）存放在潔凈(jing)、幹燥、不含防(fang)腐劑的容(rong)器內備用。

2. 取3ml樣本於15ml離心管(guan)中，依次加(jia)入(ru)3ml去離(li)子水，0.3ml 1M 鹽酸(suan)和0.2ml衍生(sheng)化試劑，劇烈(lie)振蕩(dang)混勻(yun)1min；

3. 將上(shang)述(shu)15ml離心管(guan)在90℃水浴(yu)條件(jian)下(xia)孵(fu)育(yu)10分鐘；

4. 取出(chu)後依次加(jia)入(ru)，0.2ml 1M 氫氧(yang)化鈉,劇烈(lie)振蕩(dang)混勻(yun)30秒，再(zai)加(jia)入(ru)4ml乙酸乙酯，充(chong)分振蕩(dang)混勻(yun)1min，在室(shi)溫下（20-25℃）4000轉(zhuan)/分鐘，離心3min（備註(zhu)：若無(wu)離(li)心機設(she)備，將離(li)心管(guan)靜置(zhi)30min以(yi)上(shang)使樣本溶(rong)液分層(ceng)）；

5. 移取(qu)離心後的上(shang)層(ceng)溶(rong)液2ml於5ml離心管(guan)中，60℃下氮(dan)氣/空氣(qi)吹(chui)幹；

6. 向吹(chui)幹的離心管(guan)中加(jia)入(ru)1ml正己烷(wan)，先將(jiang)管(guan)壁殘(can)余(yu)物完(wan)quan振蕩(dang)

溶(rong)解(jie)，然後加(jia)入(ru)1ml稀釋(shi)好(hao)的1×復溶(rong)液，在室(shi)溫下（20-25℃）

4000r/min以(yi)上(shang)離心5min。

7、取50µl下層(ceng)用於分析。

【酶標免疫(yi)分析程(cheng)序】

操作(zuo)步(bu)驟(zhou)：

1、 從4℃冷藏(zang)環(huan)境(jing)中(zhong)取出(chu)所需試劑，置(zhi)室(shi)溫（20-25℃）平衡30min以(yi)上(shang)，註(zhu)意(yi)每種(zhong)液體試劑使(shi)用前(qian)均須(xu)搖(yao)勻。

2、 取出(chu)需(xu)要數量(liang)的微孔及(ji)框架(jia)，將不(bu)用的微孔放入(ru)自封(feng)袋(dai)，保存於2-8℃。

3、 編號：將樣本和標準品(pin)對(dui)應微孔按序(xu)編(bian)號，每個樣本和標準品(pin)做(zuo)2孔平行，並記(ji)錄標準孔(kong)和樣本孔(kong)所在的位(wei)置(zhi)。

4、 加(jia)標準品(pin)/樣本 50µl/孔到(dao)各(ge)自的微孔中，加(jia)入(ru)酶標記(ji)物50µl/孔,然後加(jia)入(ru)抗體(ti)50µl/孔，用蓋(gai)板膜封板，輕輕震蕩(dang)混勻(yun)。25℃環(huan)境(jing)中(zhong)反應30min。

5、 取出(chu)將(jiang)孔(kong)內液體甩幹，用洗(xi)液250µl/孔洗(xi)板4-5次，每次間隔(ge)15-30秒，用吸(xi)水紙墊好(hao)後拍幹（拍幹後未被清(qing)除的氣(qi)泡可(ke)用幹凈(jing)的槍頭刺(ci)破(po)）。

6、 顯色：每孔加(jia)入(ru)底(di)物(wu)A液50µl，再(zai)加(jia)底(di)物(wu)B液50µl，輕輕振蕩(dang)混勻(yun)，25℃環(huan)境(jing)中(zhong)避光(guang)顯色15min。

7、 測(ce)定：每孔(kong)加(jia)入(ru)終止(zhi)液50µl，輕輕振蕩(dang)混勻(yun)，設(she)定酶標儀(yi)於450nm處（建(jian)議(yi)用雙(shuang)波(bo)長(chang)450/630nm檢測(ce)，在(zai)5min內讀(du)完(wan)數據(ju)），測(ce)定每孔(kong)OD值。

【結(jie)果(guo)判(pan)定】

結果(guo)判(pan)定有(you)兩(liang)種(zhong)方法，粗略(lve)判(pan)定可(ke)用第1種(zhong)方法，定量判(pan)定用第2種(zhong)方法。註(zhu)意(yi)樣本吸(xi)光(guang)值(zhi)與(yu)AHD的含量(liang)成負(fu)相(xiang)關(guan)。

1、粗略(lve)判(pan)定：

用樣品的平均吸光(guang)度(du)值與(yu)標準值(zhi)比較即(ji)可(ke)得(de)出(chu)樣本所含AHD濃度(du)範(fan)圍（ng/ml）。假設(she)樣品1的吸(xi)光(guang)度(du)值為(wei)0.239，樣品2的吸(xi)光(guang)度(du)值為(wei)1.1270，標準液吸光(guang)度(du)值分別是：0ppb為(wei)1.821；0.05ppb為(wei)1.464；0.15ppb為(wei)1.163； 0.45ppb為(wei)0.677； 1.35ppb為(wei)0.297； 4.05ppb為(wei)0.104。則(ze)樣品1的濃(nong)度範圍(wei)1.35ppb-4.05ppb；樣品2的濃(nong)度範圍(wei)0.15ppb-0.45ppb。乘(cheng)以(yi)其對(dui)應的稀(xi)釋倍(bei)數(shu)即(ji)為(wei)樣本中(zhong)AHD實(shi)際濃(nong)度(du)。

2、定量判(pan)定：

所獲得(de)的每(mei)個濃度(du)標準溶(rong)液和樣本吸(xi)光(guang)度(du)值的平均值（B）除以(yi)第壹個標準（0標準）的吸(xi)光(guang)度(du)值（B₀）再(zai)乘(cheng)以(yi)100%，即(ji)百分吸光(guang)度(du)值。

B—標準溶(rong)液或樣本溶(rong)液的平均吸光(guang)度(du)值

B₀—0ng/ml標準溶(rong)液的平均吸光(guang)度(du)值

以(yi)標準品(pin)百分吸光(guang)率(lv)為(wei)縱坐(zuo)標，以(yi)AHD標準品(pin)濃(nong)度（ng/ml）的半(ban)對(dui)數(shu)為(wei)橫坐(zuo)標，繪(hui)制標準曲(qu)線圖(tu)。將(jiang)樣本的百分吸光(guang)率(lv)代入(ru)標準曲(qu)線中(zhong)，從標準曲(qu)線上(shang)讀出(chu)樣本所對(dui)應的濃(nong)度，乘(cheng)以(yi)其對(dui)應的稀(xi)釋倍(bei)數(shu)即(ji)為(wei)樣本中(zhong)AHD實(shi)際濃(nong)度(du)。

若利用試劑盒專業分析軟件進(jin)行計算，更(geng)便於大量(liang)樣品的準(zhun)確、快速(su)分析。

3、標準準(zhun)曲(qu)線：

B/B0 (%)

         0.05      0.15      0.45       1.35       4.05

AHD(ppb) [µg/kg]

圖1： 呋喃妥(tuo)因代謝(xie)物(wu)檢測(ce)試劑盒的回(hui)歸曲(qu)線

4、再(zai)現性(xing)：

%CV

          0      0.05    0.15    0.45    1.35     4.05

                                         AHD(ppb) [µg/kg]

        圖2：呋喃妥(tuo)因代謝(xie)物(wu)檢測(ce)試劑盒的精(jing)密度

由多個不同的實(shi)驗(yan)結果(guo)確定了(le)精密(mi)度，圖(tu)2顯示出(chu)呋喃妥(tuo)因代謝(xie)物(wu)檢測(ce)試劑盒的精(jing)密度情(qing)況(kuang)，獲得(de)的標準吸(xi)收(shou)值的變(bian)異系數(shu)（%CV）對(dui)相(xiang)應呋喃妥(tuo)因濃度(du)作(zuo)曲(qu)線，可(ke)以(yi)看(kan)到(dao)在(zai)全部範圍(wei)內變(bian)異系數(shu)如此之低(di)，可(ke)以(yi)得到(dao)很(hen)好的再(zai)現性(xing)。

【註(zhu)意(yi)事(shi)項】  

1、 使用前(qian)將(jiang)所有(you)試劑溫度回(hui)升(sheng)至(zhi)室(shi)溫20-25℃。試劑及(ji)標本沒(mei)有(you)回(hui)到室(shi)溫（20-25℃）會(hui)導致(zhi)所有(you)標準的OD值(zhi)偏低(di)。

2、 在洗(xi)板過程(cheng)中如果(guo)出(chu)現板孔幹燥的情(qing)況(kuang)，則會(hui)伴(ban)隨著出(chu)現標準曲(qu)線不(bu)成(cheng)線(xian)性(xing)，重復性(xing)不好(hao)的現象(xiang)。所以(yi)洗板拍幹後應立即(ji)進(jin)行下(xia)壹(yi)步(bu)操作(zuo)。

3、 混合(he)要均勻，否(fou)則會(hui)出(chu)現重復性(xing)不好(hao)的現象(xiang)。

4、 反應終止液為(wei)2M硫(liu)酸(suan)，避(bi)免接(jie)觸皮膚(fu)。

5、 不要使用過了(le)有(you)效(xiao)日期(qi)的試劑盒，稀釋或攙(chan)雜(za)使用會(hui)引起靈敏度、OD值的變(bian)化。不要交(jiao)換使(shi)用不(bu)同批(pi)號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進(jin)自封(feng)袋(dai)密封；標準物(wu)質(zhi)和無(wu)色的發色劑對(dui)光(guang)敏感，因(yin)此要避免直接(jie)暴(bao)露(lu)在(zai)光(guang)線(xian)下。

7、 顯色液若有(you)任何(he)顏色表明(ming)變(bian)質(zhi)，應當(dang)棄(qi)之。0標準的吸(xi)光(guang)度(du)值小(xiao)於0.5個單(dan)位(wei)（A_450nm< 0.5 ）時，表示(shi)試劑可(ke)能(neng)變(bian)質(zhi)。

8、 該試劑盒最(zui)佳反應溫度為(wei)25℃，溫度過高(gao)或過低(di)將(jiang)導致(zhi)檢測(ce)吸(xi)光(guang)度(du)值和靈敏度發生(sheng)變(bian)化。

【儲存】

原包(bao)裝(zhuang)應儲存於2～8℃保鮮冷(leng)藏(zang)，切勿冷凍。

【有(you)效(xiao)期】

有(you)效(xiao)期12個月(yue);生(sheng)產日(ri)期、有(you)效(xiao)期、生(sheng)產批(pi)號見外(wai)包(bao)裝(zhuang)。