呋(fu)喃(nan)妥因(yin)代(dai)謝物ELISA試劑(ji)盒簡介

                     呋喃(nan)妥因(yin)代(dai)謝物ELISA試劑(ji)盒

使(shi)用(yong)說明(ming)書(shu)

【產品簡(jian)介】

硝(xiao)基呋(fu)喃(nan)類(lei)藥物因(yin)有(you)非(fei)常好的抗菌(jun)作用(yong)和(he)藥動力(li)學的特性(xing)，曾經被廣(guang)泛應(ying)用(yong)，作為禽類(lei)、水產和(he)豬(zhu)促(cu)生長(chang)的添(tian)加(jia)劑(ji)。呋喃(nan)妥因(yin)在1995年(nian)被禁(jin)用(yong)。由(you)於硝(xiao)基呋(fu)喃(nan)類(lei)藥物在體(ti)內很快(kuai)就能被代(dai)謝，而(er)在組織中結(jie)合的代(dai)謝產(chan)物則(ze)能存(cun)留較(jiao)長(chang)的壹段(duan)時(shi)間(jian)，所(suo)以(yi)管理(li)部門就以(yi)檢測(ce)代(dai)謝產(chan)物為手(shou)段(duan)達(da)到(dao)檢(jian)測(ce)硝(xiao)基呋(fu)喃(nan)類(lei)殘(can)留的目(mu)的。

呋喃(nan)妥因(yin)代(dai)謝物快(kuai)速檢(jian)測(ce)試劑(ji)盒具有方便、快(kuai)速、靈(ling)敏(min)等(deng)特點(dian)，適(shi)用(yong)於動物組織（水產、雞(ji)、豬(zhu)、牛(niu)）、牛(niu)奶(nai)等(deng)大批量樣品中的呋喃(nan)妥因(yin)代(dai)謝物快(kuai)速檢測(ce)。

【測(ce)定(ding)原(yuan)理】

本試劑(ji)盒采用(yong)間(jian)接競爭ELISA方法(fa)檢(jian)測(ce)水產和(he)雞(ji)肉等(deng)組織樣本中的AHD，在微孔(kong)條(tiao)上(shang)預(yu)包被上(shang)偶聯(lian)抗(kang)原(yuan)，利用(yong)抗(kang)原(yuan)與抗(kang)體(ti)的特異性(xing)免(mian)疫化學(xue)反(fan)應(ying)的原(yuan)理來(lai)進(jin)行(xing)的，樣本(ben)中(zhong)的AHD和微孔(kong)條(tiao)上(shang)預(yu)包被偶聯(lian)抗(kang)原(yuan)競爭抗呋喃(nan)妥因(yin)代(dai)謝物的衍(yan)生物抗(kang)體(ti)，加(jia)入(ru)酶(mei)標(biao)記物後(hou)，用(yong)TMB底物顯色(se)，樣品中(zhong)的AHD含量與樣品的吸光(guang)度值呈反(fan)比(bi)，與(yu)標(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)比(bi)較(jiao)即(ji)可(ke)得出呋喃(nan)妥因(yin)代(dai)謝物含量。

【試劑(ji)盒技(ji)術指(zhi)標(biao)】   

規       格：96孔(kong)/盒

靈(ling) 敏(min) 度： 0.05ppb

檢測(ce)時(shi)間(jian)： 45min

樣本檢(jian)測(ce)下(xia)限：

水產品、動(dong)物組織……………………… 0.3ppb

蜂蜜(mi)……………………………………… 0.3ppb

參考標(biao)準(zhun)GB/T 21311-2007 檢測(ce)下(xia)限為0.5ppb

交叉反(fan)應(ying)率(lv)：

呋喃(nan)妥因(yin)代(dai)謝物……………………………… 100%

呋喃(nan)西林(lin)代(dai)謝物………………………………﹤0.1%

呋喃(nan)它酮代(dai)謝物………………………………﹤0.1%

呋喃(nan)唑酮代(dai)謝物………………………………﹤0.1%

回(hui)收(shou)率(lv)：

組織、肝臟………………………………90%±15%

蜂蜜(mi)、牛奶、腸(chang)衣………………………80%±15%

【試劑(ji)盒組成(cheng)】   

1、 微量測(ce)試孔(kong)：1×96孔(kong)板(ban)（12條(tiao)×8孔(kong)）

2、 標(biao)準(zhun)液×6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb

3、 高(gao)濃(nong)度標(biao)準(zhun)品×1瓶：（1ml/瓶）100ppb

4、 酶標(biao)記物      7ml………………… 紅(hong)色(se)帽

5、 抗體(ti)工作液  7ml………………… 藍(lan)色(se)帽

6、 底物A液     7 ml………………… 棕色(se)帽

7、 底物B液     7 ml ………………… 黑(hei)色(se)帽

8、 終(zhong)止液     　7 ml ………………… 黃色(se)帽

9、 20×濃(nong)縮(suo)洗滌(di)液40 ml…………… 白色(se)帽

10、 2×濃(nong)縮(suo)復(fu)溶(rong)液 50 ml …………… 藍(lan)色(se)帽

11、 衍(yan)生化(hua)試劑(ji)　 10ml ………………黑(hei)色(se)帽

【所用(yong)儀(yi)器、試劑(ji)】   

具備的儀(yi)器：微孔(kong)酶標(biao)儀(yi)、打(da)印機、均(jun)質(zhi)器 、氮氣(qi)吹幹(gan)裝置(zhi)、振蕩(dang)器、離心(xin)機(ji)、刻度移液管、天(tian)平（感(gan)量0.01g）

微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、 多道250µl

試          劑(ji)：氫氧化(hua)鈉(na)、乙酸乙酯、正己(ji)烷(wan)、磷(lin)酸氫二鉀(jia)、濃(nong)HCl

【實(shi)驗(yan)前(qian)溶(rong)液配(pei)制(zhi)】

配液1、將2×濃(nong)縮(suo)復(fu)溶(rong)液用(yong)去(qu)離子水按(an)照(zhao)1：1稀釋(shi)（1 份(fen)濃(nong)縮(suo)復(fu)溶(rong)液+1份(fen)去(qu)離(li)子(zi)水）用(yong)於樣本(ben)的復(fu)溶(rong)。

配液2、將40ml濃(nong)縮(suo)洗滌(di)液（20倍(bei)濃(nong)縮(suo)）用(yong)去(qu)離子水按(an)照(zhao) 1：19稀釋(shi)（1份(fen)濃(nong)縮(suo)洗滌(di)液+19份(fen)去(qu)離(li)子(zi)水），或(huo)按(an)所(suo)需(xu)用(yong)量配制(zhi)洗(xi)滌(di)液。

配液3、 0.1MK₂HPO₄  稱11.4g K₂HPO₄·3H₂O

加(jia)去離子(zi)水溶(rong)解(jie)定(ding)容(rong)至(zhi)500ml。

配液4、1M HCl溶(rong)液

取8.6ml濃(nong)HCl加(jia)去離子(zi)水定(ding)溶(rong)至(zhi)100ml。

配液5、1M NaOH溶(rong)液

               取4g NaOH加(jia)去離子(zi)水定(ding)容(rong)至(zhi)100ml。

【樣本前(qian)處(chu)理方法(fa)】   

樣本處(chu)理(li)前(qian)須(xu)知

（1）本試劑(ji)盒所檢(jian)測(ce)的組織樣本包括：動(dong)物組織、禽類(lei)和水產組織。eg:雞(ji)、鴨、豬(zhu)、牛(niu)、羊、兔、魚、蝦(xia)等(deng)。

（2）實(shi)驗(yan)中(zhong)必須(xu)使用(yong)壹(yi)次性(xing)吸(xi)頭，在吸取不(bu)同(tong)的試劑(ji)時(shi)要更(geng)換吸(xi)頭。

（3）實(shi)驗(yan)前(qian)須(xu)檢查各種(zhong)實(shi)驗(yan)器具是否(fou)幹(gan)凈(jing)，必要時(shi)對(dui)實(shi)驗(yan)器具進(jin)行(xing)清潔(jie)，以(yi)避免(mian)汙染幹(gan)擾實(shi)驗(yan)結(jie)果。

樣本前(qian)處(chu)理步驟(zhou)：

該(gai)方法(fa)為氯黴素和硝(xiao)基呋(fu)喃(nan)類(lei)四(si)項(xiang)同時(shi)檢(jian)測(ce)的五合壹前(qian)處(chu)理方法(fa)；用(yong)本(ben)方法(fa)制(zhi)備(bei)出的樣品提(ti)取溶(rong)液可(ke)以(yi)直接同時(shi)應(ying)用(yong)於本公(gong)司研(yan)發(fa)的氯黴素和呋喃(nan)唑酮代(dai)謝物、呋喃(nan)妥因(yin)代(dai)謝物、呋喃(nan)妥因(yin)代(dai)謝物、呋(fu)喃(nan)西林(lin)代(dai)謝物檢(jian)測(ce)試劑(ji)盒。(備註(zhu)：使用(yong)該(gai)五合壹前(qian)處(chu)理方法(fa)檢(jian)測(ce)氯(lv)黴素時(shi)，因(yin)存(cun)在壹定(ding)的幹擾；樣本(ben)檢測(ce)下(xia)限為0.3ppb）

(a) 水產、組織、蜂蜜(mi)

1、 取2±0.05g均(jun)質(zhi)樣(yang)本樣本，加(jia)入(ru) 4ml的去離(li)子(zi)水，0.5ml1M HCl和100µl衍(yan)生化(hua)試劑(ji)，充(chong)分(fen)振(zhen)蕩(dang)。

2、 置(zhi)於37℃恒溫(wen)箱孵育(yu)過夜（大約(yue)16h）或(huo)90℃水浴(yu)中(zhong)孵育(yu)20min；

3、 分別加(jia)入(ru)5ml 0.1M K₂HPO_4， 0.4 ml 1M NaOH和5ml乙酸乙酯，充(chong)

          分振蕩(dang)2min；

4、 在室溫(wen)下(xia)（20-25℃）4000r/min以(yi)上(shang)離(li)心(xin)5min。

5、 取出2.5ml上(shang)層清亮液體(ti)到(dao)另壹(yi)潔(jie)凈離心管中，於65℃氮氣(qi)/空

氣(qi)吹幹(gan)。

6、 用(yong)1ml正己(ji)烷(wan)溶(rong)解(jie)幹(gan)燥物，加(jia)入(ru)1ml已(yi)稀釋(shi)好的復(fu)溶(rong)液充(chong)分(fen)混(hun)合

30s；在室溫(wen)下(xia)（20-25℃）4000r/min以(yi)上(shang)離(li)心(xin)5min。

7、 取50µl下層用(yong)於分析。

樣本稀釋(shi)倍(bei)數(shu)：1

(b) 特殊樣(yang)本(ben)(畜(chu)禽產品組織、肝臟、腸衣、油(you)炸(zha)食(shi)品、混(hun)合肉餡、熟(shu)食(shi)等(deng))的處理(li)方法(fa)

1、 取2±0.05g的均(jun)質(zhi)樣(yang)本於50ml離心(xin)管中(zhong)，6ml的去離(li)子(zi)水，充(chong)分(fen)振(zhen)蕩(dang)2min，加(jia)入(ru)5ml正己(ji)烷(wan)，充(chong)分(fen)混(hun)合震蕩(dang)3min,4000r/min離心10min。

2、 棄除上(shang)層有機(ji)相(xiang)液體(ti)，吸取4ml下層清澈(che)液體(ti)於另壹(yi)個(ge)50ml離心(xin)管中(zhong)，加(jia)0.5ml1M HCl和100µl衍(yan)生化(hua)試劑(ji)，充(chong)分(fen)振(zhen)蕩(dang)。

3、 置(zhi)於37℃過夜孵育(yu)（大(da)約(yue)16h）或(huo)90℃水浴(yu)中(zhong)孵育(yu)20min；

4、 分別加(jia)入(ru)5ml 0.1M K₂HPO_4， 0.4 ml 1M NaOH和5ml乙酸乙酯，充(chong)分(fen)振(zhen)蕩(dang)2min；在室溫(wen)下(xia)（20-25℃）4000r/min以(yi)上(shang)離(li)心(xin)5min。

5、 取出2.5ml上(shang)層清亮液體(ti)到(dao)另壹(yi)潔(jie)凈離心管中，於65℃氮氣(qi)  /空氣(qi)吹幹(gan)。

6、 用(yong)1ml正己(ji)烷(wan)溶(rong)解(jie)幹(gan)燥物，加(jia)入(ru)1ml已(yi)稀釋(shi)好的復(fu)溶(rong)液充(chong)分(fen)混(hun)合30s，在室溫(wen)下(xia)（20-25℃）4000r/min以(yi)上(shang)離(li)心(xin)5min。

7、 取出50µl下層用(yong)於分析。

        樣本稀釋(shi)倍(bei)數(shu)：2

【酶標(biao)免(mian)疫分析程序】

操作步驟(zhou)：

1、 從4℃冷(leng)藏環境(jing)中取出所(suo)需(xu)試劑(ji)，置(zhi)室溫(wen)（20-25℃）平衡(heng)30min以(yi)上(shang)，註(zhu)意(yi)每(mei)種(zhong)液體(ti)試劑(ji)使(shi)用(yong)前(qian)均(jun)須(xu)搖(yao)勻(yun)。

2、 取出需(xu)要數(shu)量的微孔(kong)及框(kuang)架，將不(bu)用(yong)的微孔(kong)放入(ru)自(zi)封袋(dai)，保(bao)存(cun)於2-8℃。

3、 編號：將樣(yang)本(ben)和(he)標(biao)準(zhun)品對(dui)應(ying)微(wei)孔(kong)按(an)序編號(hao)，每(mei)個樣本和標(biao)準(zhun)品做(zuo)2孔(kong)平行(xing)，並記錄(lu)標(biao)準(zhun)孔(kong)和樣(yang)本孔(kong)所在的位(wei)置(zhi)。

4、 加(jia)標(biao)準(zhun)品/樣本 50µl/孔(kong)到(dao)各自(zi)的微孔(kong)中，加(jia)入(ru)酶(mei)標(biao)記物50µl/孔(kong),然後(hou)加(jia)入(ru)抗體(ti)50µl/孔(kong)，用(yong)蓋(gai)板(ban)膜封板(ban)，輕(qing)輕(qing)震蕩(dang)混勻(yun)。25℃環境中(zhong)反(fan)應(ying)30min。

5、 取出將孔(kong)內液體(ti)甩(shuai)幹，用(yong)洗(xi)液250µl/孔(kong)洗板(ban)4-5次，每(mei)次間(jian)隔(ge)15-30秒(miao)，用(yong)吸(xi)水紙墊好後拍(pai)幹(gan)（拍(pai)幹(gan)後(hou)未(wei)被清(qing)除的氣(qi)泡可(ke)用(yong)幹(gan)凈的槍(qiang)頭(tou)刺(ci)破）。

6、 顯色(se)：每(mei)孔(kong)加(jia)入(ru)底(di)物A液50µl，再(zai)加(jia)底物B液50µl，輕輕振(zhen)蕩(dang)混勻(yun)，25℃環境中(zhong)避光(guang)顯色(se)15min。

7、 測(ce)定(ding)：每(mei)孔(kong)加(jia)入(ru)終(zhong)止液50µl，輕輕振(zhen)蕩(dang)混勻(yun)，設(she)定(ding)酶(mei)標(biao)儀(yi)於450nm處（建議用(yong)雙波長450/630nm檢測(ce)，在5min內讀完(wan)數(shu)據），測(ce)定(ding)每(mei)孔(kong)OD值。

【結(jie)果判(pan)定(ding)】

結(jie)果判(pan)定(ding)有(you)兩種(zhong)方法(fa)，粗略(lve)判(pan)定(ding)可(ke)用(yong)第1種(zhong)方法(fa)，定(ding)量判(pan)定(ding)用(yong)第2種(zhong)方法(fa)。註(zhu)意(yi)樣(yang)本吸光(guang)值(zhi)與(yu)AHD的含量成負相(xiang)關。

1、粗略(lve)判(pan)定(ding)：

用(yong)樣(yang)品的平均(jun)吸(xi)光(guang)度值與標(biao)準(zhun)值(zhi)比較即(ji)可(ke)得出樣(yang)本(ben)所含AHD濃(nong)度範圍（ng/ml）。假設(she)樣(yang)品1的吸光(guang)度值為0.239，樣品2的吸光(guang)度值為1.1270，標(biao)準(zhun)液吸(xi)光(guang)度值分別是：0ppb為1.821；0.05ppb為1.464；0.15ppb為1.163； 0.45ppb為0.677； 1.35ppb為0.297； 4.05ppb為0.104。則樣(yang)品1的濃(nong)度範圍1.35ppb-4.05ppb；樣品2的濃(nong)度範圍0.15ppb-0.45ppb。乘以(yi)其(qi)對(dui)應(ying)的稀釋(shi)倍(bei)數(shu)即(ji)為樣本(ben)中AHD實(shi)際(ji)濃(nong)度。

2、定(ding)量判(pan)定(ding)：

所獲(huo)得的每(mei)個濃(nong)度標(biao)準(zhun)溶(rong)液和(he)樣本(ben)吸光(guang)度值的平均(jun)值(zhi)（B）除以(yi)第壹個標(biao)準(zhun)（0標(biao)準(zhun)）的吸光(guang)度值（B₀）再(zai)乘以(yi)100%，即(ji)百(bai)分吸光(guang)度值。

B—標(biao)準(zhun)溶(rong)液或(huo)樣本(ben)溶(rong)液的平均(jun)吸(xi)光(guang)度值

B₀—0ng/ml標(biao)準(zhun)溶(rong)液的平均(jun)吸(xi)光(guang)度值

以(yi)標(biao)準(zhun)品百(bai)分吸(xi)光(guang)率(lv)為縱坐(zuo)標(biao)，以(yi)AHD標(biao)準(zhun)品濃(nong)度（ng/ml）的半對(dui)數(shu)為橫(heng)坐(zuo)標(biao)，繪(hui)制(zhi)標(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)圖(tu)。將樣(yang)本(ben)的百分(fen)吸(xi)光(guang)率(lv)代(dai)入(ru)標(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)中(zhong)，從(cong)標(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)上(shang)讀出樣(yang)本(ben)所對(dui)應(ying)的濃(nong)度，乘以(yi)其(qi)對(dui)應(ying)的稀釋(shi)倍(bei)數(shu)即(ji)為樣本(ben)中AHD實(shi)際(ji)濃(nong)度。

若利用(yong)試劑(ji)盒專(zhuan)業(ye)分析軟(ruan)件(jian)進(jin)行(xing)計(ji)算(suan)，更便於大量樣品的準確(que)、快(kuai)速分(fen)析。

3、標(biao)準(zhun)準(zhun)曲(qu)線(xian)：

B/B0 (%)

         0.05      0.15      0.45       1.35       4.05

AHD(ppb) [µg/kg]

圖(tu)1： 呋喃(nan)妥因(yin)代(dai)謝物檢(jian)測(ce)試劑(ji)盒的回(hui)歸曲(qu)線(xian)

4、再(zai)現(xian)性(xing)：

%CV

          0      0.05    0.15    0.45    1.35     4.05

                                         AHD(ppb) [µg/kg]

        圖(tu)2：呋喃(nan)妥因(yin)代(dai)謝物檢(jian)測(ce)試劑(ji)盒的精(jing)密(mi)度

由多個(ge)不(bu)同(tong)的實(shi)驗(yan)結(jie)果確定(ding)了(le)精(jing)密(mi)度，圖(tu)2顯示(shi)出呋喃(nan)妥因(yin)代(dai)謝物檢(jian)測(ce)試劑(ji)盒的精(jing)密(mi)度情(qing)況(kuang)，獲(huo)得的標(biao)準(zhun)吸(xi)收(shou)值的變(bian)異(yi)系數(shu)（%CV）對相(xiang)應(ying)呋喃(nan)妥因(yin)濃(nong)度作曲(qu)線(xian)，可(ke)以(yi)看到(dao)在全部範(fan)圍內變(bian)異(yi)系數(shu)如此之低(di)，可以(yi)得到(dao)很好的再(zai)現(xian)性(xing)。

【註(zhu)意(yi)事(shi)項(xiang)】  

1、 使用(yong)前(qian)將所(suo)有(you)試劑(ji)溫(wen)度回(hui)升(sheng)至(zhi)室(shi)溫(wen)20-25℃。試劑(ji)及(ji)標(biao)本(ben)沒(mei)有回(hui)到(dao)室(shi)溫(wen)（20-25℃）會(hui)導(dao)致所有標(biao)準(zhun)的OD值偏低(di)。

2、 在洗板(ban)過程中(zhong)如果出現(xian)板(ban)孔(kong)幹燥的情(qing)況(kuang)，則會(hui)伴隨著出現(xian)標(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)不(bu)成(cheng)線(xian)性(xing)，重復(fu)性(xing)不(bu)好的現(xian)象(xiang)。所(suo)以(yi)洗板(ban)拍(pai)幹(gan)後(hou)應(ying)立(li)即(ji)進(jin)行(xing)下壹(yi)步操作。

3、 混合要均(jun)勻(yun)，否(fou)則(ze)會(hui)出現(xian)重復(fu)性(xing)不(bu)好的現(xian)象(xiang)。

4、 反(fan)應(ying)終(zhong)止液為2M硫酸，避免(mian)接觸皮(pi)膚。

5、 不(bu)要使(shi)用(yong)過了(le)有效(xiao)日(ri)期(qi)的試劑(ji)盒，稀釋(shi)或(huo)攙雜使用(yong)會(hui)引(yin)起靈(ling)敏(min)度、OD值的變(bian)化(hua)。不(bu)要交(jiao)換使(shi)用(yong)不(bu)同(tong)批號的盒中試劑(ji)。

6、 不(bu)用(yong)的微孔(kong)板(ban)放(fang)進(jin)自(zi)封袋(dai)密(mi)封；標(biao)準(zhun)物質(zhi)和(he)無色(se)的發色(se)劑(ji)對(dui)光(guang)敏(min)感(gan)，因(yin)此要避免(mian)直(zhi)接暴露在光(guang)線(xian)下(xia)。

7、 顯色(se)液若有(you)任(ren)何顏(yan)色(se)表(biao)明(ming)變(bian)質(zhi)，應(ying)當(dang)棄(qi)之。0標(biao)準(zhun)的吸光(guang)度值小於0.5個單位(wei)（A_450nm< 0.5 ）時(shi)，表(biao)示試劑(ji)可(ke)能變(bian)質(zhi)。

8、 該(gai)試劑(ji)盒最(zui)佳(jia)反(fan)應(ying)溫(wen)度為25℃，溫(wen)度過高(gao)或(huo)過低(di)將導(dao)致檢測(ce)吸(xi)光(guang)度值和靈(ling)敏(min)度發生變(bian)化(hua)。

【儲存(cun)】

原(yuan)包裝應(ying)儲(chu)存(cun)於2～8℃保鮮(xian)冷(leng)藏，切勿冷(leng)凍(dong)。

【有效期(qi)】

有效期(qi)12個月;生產(chan)日(ri)期(qi)、有(you)效(xiao)期(qi)、生產(chan)批號見(jian)外(wai)包裝。