呋喃(nan)唑酮(tong)代謝(xie)物ELISA試(shi)劑(ji)盒簡介

  呋喃(nan)唑酮(tong)代謝(xie)物ELISA試(shi)劑(ji)盒

使(shi)用說明書

【產(chan)品簡(jian)介(jie)】

硝基(ji)呋喃(nan)類(lei)藥物(wu)因(yin)有(you)非(fei)常好(hao)的抗菌作(zuo)用和(he)藥動(dong)力學的特性，曾經被(bei)廣(guang)泛(fan)應(ying)用，作(zuo)為(wei)禽(qin)類(lei)、水(shui)產(chan)和(he)豬促(cu)生(sheng)長的添(tian)加(jia)劑(ji)。呋喃(nan)唑酮(tong)在(zai)1995年被(bei)禁用。由(you)於硝基(ji)呋喃(nan)類(lei)藥物(wu)在(zai)體內(nei)很(hen)快(kuai)就能被(bei)代(dai)謝(xie)，而在(zai)組(zu)織中(zhong)結(jie)合(he)的代(dai)謝(xie)產物則(ze)能存(cun)留(liu)較(jiao)長的壹(yi)段(duan)時間，所以(yi)管(guan)理部(bu)門(men)就(jiu)以(yi)檢(jian)測(ce)代謝產物(wu)為(wei)手段(duan)達到(dao)檢測硝基(ji)呋喃(nan)類(lei)殘留(liu)的目的。

呋喃(nan)唑酮(tong)代謝(xie)物快(kuai)速(su)檢(jian)測(ce)試(shi)劑(ji)盒具(ju)有(you)方便、快(kuai)速(su)、靈(ling)敏(min)等特點(dian)，適用於動物(wu)組(zu)織（水(shui)產(chan)、雞、豬、牛(niu)）、牛(niu)奶等大批量樣品中(zhong)的呋喃(nan)唑酮(tong)代謝(xie)物快(kuai)速(su)檢(jian)測。

【測(ce)定原(yuan)理】

本(ben)試(shi)劑(ji)盒采用間接(jie)競(jing)爭ELISA方(fang)法檢(jian)測(ce)水(shui)產(chan)等組(zu)織樣本中(zhong)的AOZ，在(zai)微孔條上(shang)預包(bao)被(bei)上(shang)偶聯抗原(yuan)，利(li)用抗原(yuan)與(yu)抗體的特異(yi)性免疫化學反應(ying)的原(yuan)理來(lai)進(jin)行的，樣本中(zhong)的AOZ和(he)微孔條上(shang)預包(bao)被(bei)偶聯抗原(yuan)競(jing)爭抗呋喃(nan)唑酮(tong)代謝(xie)物的衍(yan)生(sheng)物(wu)抗體，加(jia)入酶(mei)標(biao)記物後(hou)，用TMB底(di)物顯(xian)色，樣品中(zhong)的AOZ含(han)量與樣品的吸(xi)光度值(zhi)呈(cheng)反(fan)比，與(yu)標(biao)準曲(qu)線(xian)比較(jiao)即(ji)可(ke)得出呋喃(nan)唑酮(tong)代謝(xie)物含(han)量。

【試(shi)劑(ji)盒技術指標(biao)】   

規(gui)       格(ge)：96孔(kong)/盒(he)

靈(ling) 敏(min) 度： 0.02ppb

檢(jian)測時間： 45min

樣本檢(jian)測(ce)下限(xian)：

水(shui)產(chan)品(pin)、動物組(zu)織……………………… 0.12ppb

蜂(feng)蜜(mi)、牛(niu)奶……………………………… 0.12ppb

參(can)考(kao)標(biao)準GB/T 21311-2007 檢(jian)測下(xia)限(xian)為0.5ppb

交叉反應(ying)率(lv)：

呋喃(nan)唑(zuo)酮(tong)代謝(xie)物  …………………………  100%

呋喃(nan)它酮(tong)代謝(xie)物  …………………………﹤0.1%

呋喃(nan)妥(tuo)因(yin)代謝(xie)物(wu)  …………………………﹤0.1%

呋喃(nan)西林代謝物  …………………………﹤0.1%

回收率(lv)：

組(zu)織(zhi)…………………………………………90%±15%

蜂(feng)蜜(mi)…………………………………………85%±15%

【試(shi)劑(ji)盒組(zu)成】  

1、 微量測試(shi)孔(kong)：1×96孔(kong)板（12條×8孔(kong)）

2、 標(biao)準液(ye)X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.02ppb、0.06ppb、0.18ppb、0.54ppb、1.62ppb

3、 高濃度標(biao)準品(pin)：×1瓶：（1ml/瓶） 100ppb

4、 酶(mei)標(biao)記物    7ml………………………紅色帽

5、 抗體工作(zuo)液(ye) 7ml………………………綠色帽

6、 底(di)物A液(ye)   7 ml………………………棕(zong)色帽

7、 底(di)物B液(ye)   7 ml………………………黑(hei)色帽

8、 終止液       7 ml………………………黃色帽

9、 20X濃(nong)縮洗滌液(ye)40 ml………………白(bai)色帽

10、 2X濃(nong)縮復(fu)溶(rong)液(ye)  50 ml……………… 藍(lan)色帽

11、 衍(yan)生(sheng)化試(shi)劑(ji)        10ml ………………  黑(hei)色帽

【所用儀(yi)器(qi)、試(shi)劑(ji)】   

具(ju)備的儀(yi)器(qi)：微孔酶(mei)標(biao)儀(yi)、打印機、均(jun)質器(qi) 、氮(dan)氣(qi)吹(chui)幹(gan)裝置、振(zhen)蕩(dang)器(qi)、離心(xin)機、刻(ke)度移(yi)液管(guan)、天平(ping)（感(gan)量0.01g）

微量移(yi)液器(qi)：單道(dao)20µl-200µl，100µl-1000µl、 多道(dao)250µl

試(shi)          劑(ji)：氫(qing)氧化鈉、乙酸(suan)乙酯(zhi)、正己(ji)烷、磷酸(suan)氫(qing)二鉀(jia)、濃(nong)HCl

【實驗前(qian)溶液(ye)配(pei)制】

配(pei)液1、將2×濃(nong)縮復(fu)溶(rong)液(ye)用去離子(zi)水(shui)按照1：1稀(xi)釋（1 份(fen)濃縮(suo)復溶(rong)液+1份(fen)去離子(zi)水(shui)）用於樣本的復(fu)溶(rong)。

配(pei)液2、將40ml濃(nong)縮洗滌液(ye)（20倍(bei)濃縮(suo)）用去離子(zi)水(shui)按照 1：19稀(xi)釋（1份(fen)濃縮(suo)洗滌液(ye)+19份(fen)去離子(zi)水(shui)），或按所需用量配(pei)制洗滌液(ye)。

配(pei)液3、 0.1MK₂HPO₄  稱11.4g K₂HPO₄·3H₂O

加(jia)去離子(zi)水(shui)溶(rong)解(jie)定容(rong)至(zhi)500ml。

配(pei)液4、1M HCl溶(rong)液

取8.6ml濃(nong)HCl加(jia)去離子(zi)水(shui)定溶(rong)至(zhi)100ml。

配(pei)液5、1M NaOH溶(rong)液

               取4g NaOH加(jia)去離子(zi)水(shui)定容(rong)至(zhi)100ml。

【樣本前(qian)處理方(fang)法(fa)】   

樣本處(chu)理前(qian)須知

（1）本(ben)試(shi)劑(ji)盒所檢(jian)測(ce)的組(zu)織樣本包(bao)括：動物組(zu)織、禽(qin)類(lei)和(he)水(shui)產(chan)組(zu)織。eg:雞、鴨(ya)、豬、牛(niu)、羊(yang)、兔、魚、蝦等。

（2）實驗中必(bi)須使(shi)用壹次性(xing)吸(xi)頭，在(zai)吸(xi)取不(bu)同(tong)的試(shi)劑(ji)時要(yao)更換吸(xi)頭。

（3）實驗前(qian)須檢(jian)查各種(zhong)實驗器(qi)具是(shi)否幹凈(jing)，必(bi)要(yao)時對(dui)實驗器(qi)具進(jin)行清(qing)潔，以(yi)避(bi)免汙(wu)染(ran)幹(gan)擾(rao)實驗結(jie)果(guo)。

樣本前(qian)處理步(bu)驟：

該(gai)方(fang)法(fa)為氯黴素和(he)硝基(ji)呋喃(nan)類(lei)四項(xiang)同(tong)時檢測的五(wu)合(he)壹前(qian)處理方(fang)法(fa)；用本方法(fa)制備(bei)出的樣品提(ti)取溶(rong)液可(ke)以(yi)直(zhi)接(jie)同(tong)時應(ying)用於本公司研(yan)發的氯黴素和(he)呋喃(nan)唑(zuo)酮(tong)代(dai)謝物(wu)、呋喃(nan)它酮(tong)代(dai)謝物(wu)、呋喃(nan)妥(tuo)因(yin)代謝(xie)物(wu)、呋喃(nan)西林代謝物檢(jian)測(ce)試(shi)劑(ji)盒。(備(bei)註：使(shi)用該(gai)五(wu)合(he)壹前(qian)處理方(fang)法(fa)檢(jian)測氯黴素時，因(yin)存在(zai)壹(yi)定的幹(gan)擾(rao)；樣本檢(jian)測(ce)下限(xian)為0.3ppb）

(a) 水(shui)產(chan)、組(zu)織、蜂(feng)蜜(mi)

1、 取2±0.05g均(jun)質樣本樣本，加(jia)入 4ml的去離子(zi)水(shui)，0.5ml1M HCl和(he)100µl衍(yan)生(sheng)化試(shi)劑(ji)，充分(fen)振(zhen)蕩(dang)。

2、 置(zhi)於37℃恒(heng)溫箱(xiang)孵(fu)育過(guo)夜（大約16h）或90℃水(shui)浴(yu)中(zhong)孵育20min；

3、 分(fen)別加(jia)入5ml 0.1M K₂HPO_4， 0.4 ml 1M NaOH和(he)5ml乙(yi)酸(suan)乙酯(zhi)，充

          分(fen)振(zhen)蕩(dang)2min；

4、 在(zai)室(shi)溫下(xia)（20-25℃）4000r/min以(yi)上(shang)離(li)心5min。

5、 取出2.5ml上(shang)層(ceng)清(qing)亮(liang)液體到(dao)另壹(yi)潔凈(jing)離(li)心管(guan)中(zhong)，於65℃氮(dan)氣(qi)/空

氣(qi)吹幹(gan)。

6、 用1ml正(zheng)己(ji)烷溶解幹燥(zao)物(wu)，加(jia)入1ml已(yi)稀(xi)釋好的復(fu)溶(rong)液充分(fen)混(hun)合(he)

30s；在(zai)室(shi)溫下(xia)（20-25℃）4000r/min以(yi)上(shang)離(li)心5min。

7、 取50µl下(xia)層用於分(fen)析。

樣本稀(xi)釋倍數(shu)：1

(b) 特殊樣本(畜禽(qin)產(chan)品(pin)組(zu)織、肝臟、腸(chang)衣(yi)、油炸(zha)食(shi)品(pin)、混(hun)合(he)肉(rou)餡(xian)、熟(shu)食(shi)等)的處(chu)理方(fang)法(fa)

1、 取2±0.05g的均(jun)質樣本於50ml離心(xin)管(guan)中(zhong)，6ml的去離子(zi)水(shui)，充(chong)分(fen)振(zhen)蕩(dang)2min，加(jia)入5ml正(zheng)己(ji)烷，充(chong)分(fen)混(hun)合(he)震(zhen)蕩(dang)3min,4000r/min離(li)心10min。

2、 棄(qi)除上(shang)層(ceng)有(you)機相(xiang)液(ye)體，吸(xi)取4ml下(xia)層清(qing)澈液體於另壹(yi)個50ml離心(xin)管(guan)中(zhong)，加(jia)0.5ml1M HCl和(he)100µl衍(yan)生(sheng)化試(shi)劑(ji)，充分(fen)振(zhen)蕩(dang)。

3、 置(zhi)於37℃過(guo)夜孵育（大約16h）或90℃水(shui)浴(yu)中(zhong)孵育20min；

4、 分(fen)別加(jia)入5ml 0.1M K₂HPO_4， 0.4 ml 1M NaOH和(he)5ml乙(yi)酸(suan)乙酯(zhi)，充分(fen)振(zhen)蕩(dang)2min；在(zai)室(shi)溫下(xia)（20-25℃）4000r/min以(yi)上(shang)離(li)心5min。

5、 取出2.5ml上(shang)層(ceng)清(qing)亮(liang)液體到(dao)另壹(yi)潔凈(jing)離(li)心管(guan)中(zhong)，於65℃氮(dan)氣(qi)  /空氣吹(chui)幹(gan)。

6、 用1ml正(zheng)己(ji)烷溶解幹燥(zao)物(wu)，加(jia)入1ml已(yi)稀(xi)釋好的復(fu)溶(rong)液(ye)充(chong)分(fen)混(hun)合(he)30s，在(zai)室(shi)溫下(xia)（20-25℃）4000r/min以(yi)上(shang)離(li)心5min。

7、 取出50µl下(xia)層用於分(fen)析。

        樣本稀(xi)釋倍數(shu)：2

【酶(mei)標(biao)免疫分(fen)析程(cheng)序(xu)】

操(cao)作(zuo)步(bu)驟：

1、 從4℃冷(leng)藏環(huan)境(jing)中(zhong)取出所需試(shi)劑(ji)，置室(shi)溫（20-25℃）平(ping)衡30min以(yi)上(shang)，註(zhu)意(yi)每(mei)種液(ye)體試(shi)劑(ji)使(shi)用前(qian)均(jun)須搖(yao)勻(yun)。

2、 取出需要(yao)數量的微孔及(ji)框架(jia)，將不(bu)用的微孔放入自封袋，保(bao)存(cun)於2-8℃。

3、 編號：將樣本和(he)標(biao)準品(pin)對(dui)應(ying)微孔按序編號，每(mei)個(ge)樣本和(he)標(biao)準品(pin)做2孔(kong)平行，並(bing)記(ji)錄標(biao)準孔(kong)和(he)樣本孔(kong)所在(zai)的位置(zhi)。

4、 加(jia)標(biao)準品(pin)/樣本 50µl/孔(kong)到各自(zi)的微孔中，加(jia)入酶(mei)標(biao)記物50µl/孔(kong),然後(hou)加(jia)入抗體50µl/孔(kong)，用蓋板膜(mo)封板，輕輕震(zhen)蕩(dang)混(hun)勻(yun)。25℃環(huan)境(jing)中(zhong)反應(ying)30min。

5、 取出將孔(kong)內(nei)液體甩(shuai)幹(gan)，用洗液250µl/孔(kong)洗板4-5次(ci)，每次(ci)間隔(ge)15-30秒(miao)，用吸(xi)水(shui)紙墊(dian)好(hao)後(hou)拍幹(gan)（拍幹(gan)後(hou)未(wei)被(bei)清(qing)除(chu)的氣(qi)泡可(ke)用幹凈(jing)的槍(qiang)頭(tou)刺破(po)）。

6、 顯(xian)色：每孔(kong)加(jia)入底物A液(ye)50µl，再加(jia)底(di)物B液(ye)50µl，輕輕振(zhen)蕩(dang)混(hun)勻(yun)，25℃環(huan)境(jing)中(zhong)避光顯(xian)色15min。

7、 測(ce)定：每(mei)孔(kong)加(jia)入終止液50µl，輕輕振(zhen)蕩(dang)混(hun)勻(yun)，設定酶(mei)標(biao)儀(yi)於450nm處(chu)（建議用雙(shuang)波長450/630nm檢(jian)測，在(zai)5min內(nei)讀完數據），測定每(mei)孔(kong)OD值(zhi)。

【結(jie)果(guo)判定】  

結(jie)果(guo)判定有(you)兩種方法，粗略(lve)判定可(ke)用第1種(zhong)方法(fa)，定量判定用第2種方(fang)法。註(zhu)意(yi)樣本吸(xi)光值(zhi)與AOZ的含(han)量成負(fu)相(xiang)關。

1、粗略(lve)判定：

用樣品的平(ping)均(jun)吸(xi)光度值(zhi)與標(biao)準值(zhi)比較(jiao)即(ji)可(ke)得出樣本所含(han)AOZ濃(nong)度範(fan)圍（ng/ml）。假(jia)設樣品1的吸(xi)光度值(zhi)為0.268，樣品2的吸(xi)光度值(zhi)為1.230，標(biao)準液(ye)吸(xi)光度值(zhi)分(fen)別是(shi)：0ppb為(wei)1.671；0.02ppb為1.425；0.06ppb為(wei)1.103； 0.18ppb為0.567； 0.54ppb為0.205； 1.62ppb為(wei)0.104。則(ze)樣品1的濃(nong)度範(fan)圍是0.18ppb-0.54ppb；樣品2的濃(nong)度範(fan)圍是0.02ppb-0.06ppb。乘(cheng)以(yi)其(qi)對(dui)應(ying)的稀(xi)釋倍數(shu)即(ji)為樣本中(zhong)AOZ實際濃度。

2、定量判定：

   所獲(huo)得的每(mei)個(ge)濃度標(biao)準溶(rong)液和(he)樣本吸(xi)光度值(zhi)的平(ping)均(jun)值(zhi)（B）除(chu)以(yi)第(di)壹(yi)個標(biao)準（0標(biao)準）的吸(xi)光度值(zhi)（B₀）再乘以(yi)100%，即(ji)百(bai)分(fen)吸(xi)光度值(zhi).

B—標(biao)準溶(rong)液或樣本溶(rong)液(ye)的平(ping)均(jun)吸(xi)光度值(zhi)

B₀—0ng/ml標(biao)準溶(rong)液的平(ping)均(jun)吸(xi)光度值(zhi)

以(yi)標(biao)準品(pin)百(bai)分(fen)吸(xi)光率(lv)為(wei)縱坐標(biao)，以(yi)AOZ標(biao)準品(pin)濃度（ng/ml）的半對(dui)數(shu)為橫坐標(biao)，繪制標(biao)準曲(qu)線(xian)圖(tu)。將樣本的百(bai)分(fen)吸(xi)光率(lv)代(dai)入標(biao)準曲(qu)線(xian)中，從標(biao)準曲(qu)線(xian)上(shang)讀出樣本所對(dui)應(ying)的濃(nong)度，乘以(yi)其(qi)對(dui)應(ying)的稀(xi)釋倍數(shu)即(ji)為樣本中(zhong)AOZ實際濃度。

若(ruo)利用試(shi)劑(ji)盒專業分(fen)析軟(ruan)件(jian)進(jin)行計(ji)算(suan)，更便於大量樣品的準確(que)、快(kuai)速(su)分(fen)析。

3、標(biao)準準曲(qu)線(xian)：

     B/B0 (%)

        0.02     0.06       0.18       0.54       1.62

AOZ(ppb) [µg/kg]

圖(tu)1： 呋喃(nan)唑酮(tong)代謝(xie)物檢(jian)測試(shi)劑(ji)盒的回歸(gui)曲(qu)線(xian)

4、再現性(xing)：

      %CV

           0    0.02     0.06     0.18    0.54     1.62

AOZ(ppb) [µg/kg]

      圖(tu)2：呋喃(nan)唑酮(tong)代謝(xie)物檢(jian)測試(shi)劑(ji)盒的精(jing)密度

由(you)多個(ge)不(bu)同(tong)的實驗結(jie)果(guo)確(que)定了(le)精(jing)密度，圖(tu)2顯(xian)示出呋喃(nan)唑酮(tong)代謝(xie)物檢(jian)測試(shi)劑(ji)盒的精(jing)密度情況(kuang)，獲得的標(biao)準吸(xi)收值(zhi)的變異(yi)系(xi)數（%CV）對(dui)相(xiang)應(ying)呋喃(nan)唑酮(tong)濃度作(zuo)曲(qu)線(xian)，可(ke)以(yi)看到在(zai)全(quan)部範(fan)圍內(nei)變異(yi)系(xi)數如此(ci)之低，可(ke)以(yi)得到(dao)很(hen)好(hao)的再現性(xing)。

【註(zhu)意(yi)事(shi)項】  

1、 使(shi)用前(qian)將所有(you)試(shi)劑(ji)溫度回升(sheng)至室(shi)溫20-25℃。試(shi)劑(ji)及(ji)標(biao)本沒有(you)回到室(shi)溫（20-25℃）會導致所有(you)標(biao)準的OD值(zhi)偏低。

2、 在(zai)洗板過(guo)程(cheng)中(zhong)如果(guo)出現板(ban)孔(kong)幹(gan)燥的情況(kuang)，則會伴隨著(zhe)出現標(biao)準曲(qu)線(xian)不(bu)成線(xian)性，重(zhong)復性不(bu)好(hao)的現(xian)象(xiang)。所以(yi)洗板拍幹(gan)後(hou)應(ying)立(li)即(ji)進(jin)行下壹步(bu)操(cao)作(zuo)。

3、 混(hun)合(he)要(yao)均(jun)勻，否則會出現重(zhong)復(fu)性(xing)不(bu)好(hao)的現(xian)象(xiang)。

4、 反(fan)應(ying)終止液為2M硫(liu)酸(suan)，避免接(jie)觸皮膚。

5、 不(bu)要(yao)使(shi)用過(guo)了(le)有(you)效(xiao)日期的試(shi)劑(ji)盒，稀(xi)釋或攙(chan)雜(za)使(shi)用會引起(qi)靈敏(min)度、OD值(zhi)的變化。不(bu)要(yao)交換使(shi)用不(bu)同(tong)批(pi)號的盒(he)中(zhong)試(shi)劑(ji)。

6、 不(bu)用的微孔板放進(jin)自封(feng)袋密(mi)封(feng)；標(biao)準物(wu)質和(he)無(wu)色的發(fa)色劑(ji)對(dui)光(guang)敏感(gan)，因(yin)此要(yao)避免直(zhi)接(jie)暴(bao)露(lu)在(zai)光(guang)線(xian)下。

7、 顯(xian)色液若(ruo)有(you)任何(he)顏(yan)色表明(ming)變質，應(ying)當(dang)棄(qi)之(zhi)。0標(biao)準的吸(xi)光度值(zhi)小於0.5個(ge)單位（A_450nm< 0.5 ）時，表(biao)示試(shi)劑(ji)可(ke)能變質。

8、 該(gai)試(shi)劑(ji)盒最(zui)佳反(fan)應(ying)溫(wen)度為25℃，溫(wen)度過(guo)高或過(guo)低將導致檢(jian)測吸(xi)光度值(zhi)和(he)靈(ling)敏度發生(sheng)變化。

【儲(chu)存(cun)】

原(yuan)包裝(zhuang)應(ying)儲(chu)存(cun)於2～8℃保(bao)鮮冷(leng)藏，切勿(wu)冷(leng)凍(dong)。

【有(you)效(xiao)期】

有(you)效(xiao)期12個(ge)月;生(sheng)產(chan)日期、有(you)效(xiao)期、生(sheng)產(chan)批號見外包裝。