伏馬(ma)毒素(su)ELISA試劑盒說明(ming)書(shu)

伏(fu)馬(ma)毒素(su)快速(su)檢測試劑盒

使用(yong)說(shuo)明(ming)書(shu)

【原理】

本(ben)試劑盒采(cai)用(yong)間(jian)接(jie)競爭ELISA方法(fa)，在微(wei)孔條(tiao)上(shang)預(yu)包被(bei)偶聯抗(kang)原，樣(yang)本(ben)中的(de)殘(can)留物(wu)伏(fu)馬(ma)毒素(su)與(yu)微(wei)孔條(tiao)上(shang)預(yu)包被(bei)的偶(ou)聯抗(kang)原競爭其抗體，加(jia)入(ru)酶標(biao)記(ji)物(wu)後(hou)，用(yong)TMB底物(wu)顯色(se)，樣(yang)本(ben)吸光值與(yu)其所含(han)伏(fu)馬(ma)毒素(su)的(de)含(han)量(liang)成負相(xiang)關(guan)，與(yu)標(biao)準曲(qu)線比(bi)較(jiao)即(ji)可得出(chu)殘(can)留物(wu)伏(fu)馬(ma)毒素(su)的(de)含(han)量(liang)。

【試劑盒技術(shu)指標(biao)】   

規(gui)      格(ge)：96孔(kong)/盒(he)

靈(ling) 敏 度(du)： 0.5ppb

檢(jian)測時(shi)間(jian)： 75min

樣(yang)本(ben)檢測下限(xian)：

飼(si)    料(liao)（谷(gu)物(wu)、豆(dou)類(lei)）…………………………50ppb

食用(yong)油(you)…………………………………………12.5ppb

樣(yang)本(ben)回收(shou)率

飼(si)    料(liao)（谷(gu)物(wu)、豆(dou)類(lei)）……………………80% ±10%

食用(yong)油(you)………………………………………80% ±10%

試 劑 盒(he) 組(zu) 成(cheng)

1、微(wei)量測試孔(kong)：每條(tiao)8孔(kong)，壹(yi)板(ban)12條(tiao)

2、標(biao) 準 液(ye)×6瓶(ping)：（1ml/瓶(ping)） 0ppb、 0.5ppb、

     1.5ppb、4.5ppb、 13.5ppb、 40.5ppb

3、酶標(biao)記(ji)物(wu)     12ml  …………………………… 紅色帽

4、抗(kang)體工(gong)作(zuo)液(ye) 7ml ………………………………綠(lv)色(se)帽

5、底物(wu)A液(ye)    7ml ………………………………棕(zong)色(se)帽

6、底物(wu)B液(ye)　7 ml………………………………黑(hei)色(se)帽

7、終止液(ye)        7 ml ………………………………黃(huang)色帽

8、2X濃(nong)縮復(fu)溶(rong)液(ye) 50 ml…………………………藍(lan)色(se)帽

9、20X濃(nong)縮洗滌(di)液(ye)40 ml………………………白(bai)色(se)帽

【所用(yong)儀(yi)器、試劑】   

具(ju)備(bei)的儀(yi)器：微(wei)孔酶標(biao)儀(yi)、打(da)印機(ji)、均(jun)質(zhi)器 、氮氣吹(chui)幹(gan)裝置(zhi)、振(zhen)蕩(dang)器、離心(xin)機(ji)、刻(ke)度(du)移(yi)液(ye)管、天(tian)平（感(gan)量(liang)0.01g）

微(wei)量移(yi)液(ye)器：單(dan)道(dao)20µl-200µl，100µl-1000µl、多(duo) 道(dao)250µl，WhatmanＮｏ１或(huo)相(xiang)當(dang)的濾紙

     試         劑：甲(jia)醇(chun)

【樣(yang)本(ben)前處(chu)理步(bu)驟(zhou)】   

樣(yang)本(ben)前處(chu)理須(xu)知(zhi)

處(chu)理任(ren)何樣(yang)本(ben)時(shi)，都必須(xu)註(zhu)意(yi)：

（a）標(biao)準液(ye)含(han)有(you)伏(fu)馬(ma)毒素(su)毒素(su)，應特別(bie)小心，使用(yong)過(guo)的(de)玻璃(li)容器及伏(fu)馬(ma)毒素(su)溶(rong)液(ye)最(zui)好(hao)用(yong)pH=7的(de)次氯(lv)酸(suan)溶液(ye)（10%V/V）浸泡(pao)過(guo)夜(ye)。

（b）實(shi)驗中必須(xu)使用(yong)壹(yi)次性(xing)吸(xi)頭(tou)，在(zai)吸取不同(tong)的試劑時(shi)要(yao)更換(huan)吸頭。

（c）實(shi)驗之(zhi)前(qian)須(xu)檢(jian)查(zha)各(ge)種實驗器具(ju)是(shi)否幹凈(jing)，必要(yao)時(shi)可對實(shi)驗器具(ju)進(jin)行清(qing)潔(jie)，以避(bi)免(mian)汙(wu)染(ran)幹(gan)擾(rao)實驗結(jie)果。

樣(yang)本(ben)前處(chu)理需(xu)配制(zhi)：

配(pei)液(ye)1、50%甲(jia)醇(chun)溶液(ye)：

        50ml蒸(zheng)餾(liu)水或(huo)去(qu)離(li)子水(shui)和(he)50ml純(chun)甲(jia)醇(chun)混(hun)合(he)制(zhi)

         備(bei)50％甲(jia)醇(chun)溶液(ye)。

配(pei)液(ye)2、樣(yang)本(ben)復(fu)溶(rong)液(ye)：

           將(jiang)2×濃(nong)縮復(fu)溶(rong)液(ye)用(yong)去(qu)離(li)子水以1：1稀釋(shi)（1

          份(fen)濃(nong)縮復(fu)溶(rong)液(ye)+1份(fen)去(qu)離(li)子(zi)水(shui)），用(yong)於(yu)樣(yang)本(ben)提取(qu)

          後(hou)的(de)復(fu)溶(rong)。

（a ）飼(si)料(liao)（谷(gu)物(wu)、豆(dou)類(lei)）

1、稱(cheng)取(qu)2g粉碎的有(you)代(dai)表性(xing)的(de)樣(yang)品(pin)於離心管中，加入(ru)10ml 50%甲(jia)醇(chun)溶液(ye)混(hun)合(he)；強(qiang)力振(zhen)蕩3分(fen)鐘。

2、用(yong)Whatman No.濾紙過(guo)濾；收(shou)集過(guo)濾液(ye)。

3、取(qu)出(chu)上(shang)清(qing)液(ye)50ul與(yu)樣(yang)本(ben)稀釋(shi)液(ye)950ul 充分(fen)混(hun)合(he)30s

      取(qu)50ul進(jin)行分(fen)析(xi)。

        樣(yang)本(ben)稀釋(shi)倍數(shu):100

(b)食用(yong)油(you)(如(ru)菜(cai)油(you)、麻(ma)油、色拉油、花生(sheng)油等(deng))

1、稱(cheng)取(qu)1g油(you)樣(yang)品(pin)於10ml離(li)心(xin)管中，先(xian)加(jia)入(ru)2ml 正(zheng)己(ji)烷，再(zai)加入(ru)5ml的(de)50%甲(jia)醇(chun)溶液(ye)混(hun)合(he)；強(qiang)力振(zhen)蕩5min；室(shi)溫(wen)4000r/min以(yi)上(shang)，離(li)心10min。

2、取(qu)下層(ceng)溶(rong)液(ye)50ul與(yu)稀釋(shi)後的(de)復(fu)溶(rong)液(ye)200ul 充分(fen)混(hun)合(he)30s

      取(qu)50ul進(jin)行分(fen)析(xi)。

     樣(yang)本(ben)稀釋(shi)倍數(shu):25

【酶標(biao)免疫分(fen)析(xi)程序(xu)】   

測定(ding)前(qian)應須(xu)知(zhi)：

1、使用(yong)之(zhi)前(qian)將(jiang)所有(you)試劑和(he)需(xu)用(yong)板(ban)條(tiao)的(de)溫度回升至(zhi)室(shi)溫

     （20-25℃）。

2、使用(yong)之(zhi)後(hou)立即(ji)將(jiang)所有(you)試劑放(fang)回(hui)2-8℃環(huan)境。

3、在(zai)ELISA分(fen)析(xi)中(zhong)的再(zai)現性(xing)，很大(da)程度(du)上(shang)取(qu)決(jue)於(yu)洗板(ban)

     的(de)壹(yi)致性(xing)，正(zheng)確的洗(xi)板(ban)操(cao)作(zuo)是ELISA測定(ding)程序(xu)中(zhong)的

     要(yao)點(dian)。

4、在(zai)所有(you)恒(heng)溫孵育(yu)過(guo)程中(zhong)，避(bi)免光線照(zhao)射，用(yong)蓋(gai)板(ban)膜

      封(feng)住(zhu)微(wei)孔板(ban)。

操(cao)作(zuo)步驟(zhou)：

1、 將(jiang)所需(xu)試劑從(cong)冷(leng)藏環(huan)境中(zhong)取(qu)出(chu)，置(zhi)室(shi)溫(wen)（20-25℃）平衡(heng)30min以(yi)上(shang)，註(zhu)意(yi)每種(zhong)液(ye)體試劑使用(yong)前(qian)均(jun)須(xu)搖(yao)勻。

2、 按(an)板(ban)架及(ji)需(xu)要(yao)取(qu)出(chu)微(wei)孔條(tiao)，將(jiang)不(bu)用(yong)的(de)微(wei)孔放(fang)入(ru)自封(feng)袋(dai)，保存於2-8℃。

3、 配(pei)液(ye)：將(jiang)40ml濃(nong)縮洗滌(di)液(ye)（20倍(bei)濃(nong)縮）用(yong)去(qu)離(li)子水按(an)照(zhao)1：19稀釋(shi)（1份(fen)濃(nong)縮洗滌(di)液(ye)+19份(fen)去(qu)離(li)子(zi)水(shui)），或(huo)按(an)所需(xu)用(yong)量(liang)配(pei)制(zhi)洗(xi)滌(di)液(ye)。

4、 編(bian)號(hao)：將(jiang)樣(yang)本(ben)和(he)標(biao)準品(pin)對應微(wei)孔按(an)序(xu)編(bian)號(hao)每個(ge)樣(yang)本(ben)和(he)標(biao)準品(pin)做2孔(kong)平行，並(bing)記(ji)錄標(biao)準孔(kong)和(he)樣(yang)本(ben)孔所在(zai)的(de)位置。

5、 加(jia)標(biao)準品(pin)/樣(yang)本(ben)50µl/孔(kong)到各自(zi)的(de)微(wei)孔中(zhong)，然(ran)後加(jia)抗(kang)體50µl/孔(kong)，用(yong)蓋(gai)板(ban)膜封(feng)板(ban)，輕輕震蕩混(hun)勻。25℃環(huan)境中(zhong)反(fan)應30min。

6、 取(qu)出(chu)將(jiang)孔(kong)內液(ye)體甩(shuai)幹(gan)，用(yong)洗(xi)液(ye)250µl/孔(kong)洗(xi)板(ban)4-5次，每(mei)次間(jian)隔(ge)15-30秒，用(yong)吸(xi)水(shui)紙拍幹（拍(pai)幹後(hou)未被(bei)清除的氣(qi)泡(pao)可用(yong)幹(gan)凈(jing)的槍頭刺(ci)破）。

7、 每(mei)孔(kong)加入(ru)酶標(biao)記(ji)物(wu)100µl，蓋(gai)板(ban)膜蓋(gai)板(ban)後置(zhi)25℃環(huan)境中(zhong)反(fan)應30min。用(yong)洗(xi)液(ye)250µl/孔(kong)洗(xi)板(ban)4-5次，每(mei)次間(jian)隔(ge)15-30秒，用(yong)吸(xi)水(shui)紙拍幹（拍(pai)幹後(hou)未被(bei)清除的氣(qi)泡(pao)可用(yong)幹(gan)凈(jing)的槍頭刺(ci)破）。

8、  顯色(se)：每(mei)孔加(jia)入(ru)A液(ye)50µl，再(zai)加B液(ye)50µl，輕輕振蕩混(hun)勻，25℃環(huan)境中(zhong)避(bi)光顯色(se)15min。

9、 測定(ding)：每(mei)孔加(jia)入(ru)終止液(ye)50µl，輕輕振蕩，設(she)定(ding)酶標(biao)儀(yi)於(yu)450nm處(chu)（建(jian)議用(yong)雙(shuang)波長450/630nm檢(jian)測,在(zai)5min內(nei)讀(du)完(wan)數(shu)據(ju)）測定(ding)吸(xi)光度值（OD值）。

  【結(jie)果判(pan)定(ding)】   

        結(jie)果判(pan)定(ding)有(you)兩(liang)種(zhong)方法(fa)，粗略判定(ding)可用(yong)第(di)1種(zhong)方法(fa)， 定(ding)量(liang)判定(ding)用(yong)第(di)2種(zhong)方法(fa)。註意(yi)樣(yang)本(ben)吸光值與(yu)伏(fu)馬(ma)毒素(su)的(de)含(han)量(liang)成負相(xiang)關(guan)。

1、 粗(cu)略判定(ding)

      用(yong)樣(yang)本(ben)的平均(jun)吸(xi)光度值與(yu)標(biao)準值比(bi)較即可得出(chu)其濃(nong)度範圍(wei)(ng /ml)。假(jia)設(she)樣(yang)本(ben)1的(de)吸(xi)光度值0.241，樣(yang)本(ben)2的(de)吸(xi)光度值為(wei)0.785，標(biao)準液(ye)吸(xi)光度值分(fen)別(bie)是：0ppb為(wei)2.260；0.5ppb為(wei)1.640；1.5ppb為(wei)1.234；4.5ppb為(wei)0.680； 13.5ppb為(wei)0.348；40.5ppb為(wei)0.125。則(ze)樣(yang)本(ben)1的(de)濃(nong)度範圍(wei)是(shi)13.5ppb-40.5ppb；樣(yang)本(ben)2的(de)濃(nong)度範圍(wei)是(shi)1.5ppb-4.5ppb。乘(cheng)以(yi)其對應的(de)稀釋(shi)倍數(shu)即(ji)為(wei)樣(yang)本(ben)中伏(fu)馬(ma)毒素(su)實(shi)際(ji)含(han)量(liang)。

2、 定(ding)量(liang)分(fen)析(xi)

（1）百分(fen)吸光率的計算，標(biao)準品(pin)或(huo)樣(yang)本(ben)的百分(fen)吸光率等(deng)於(yu)標(biao)準品(pin)或(huo)樣(yang)本(ben)的百分(fen)吸光度值的(de)平均(jun)值（雙(shuang)孔）除以第(di)壹個(ge)標(biao)準（0標(biao)準）的(de)吸光度值，再(zai)乘以(yi)100%，即(ji)：

B—標(biao)準溶(rong)液(ye)或(huo)樣(yang)本(ben)溶液(ye)的(de)平均(jun)吸(xi)光度值

B₀—0ng/ml標(biao)準溶(rong)液(ye)的(de)平均(jun)吸(xi)光度值

（2）標(biao)準曲(qu)線的(de)繪(hui)制(zhi)與(yu)計算(suan)

以(yi)標(biao)準品(pin)百分(fen)吸光率為(wei)縱坐標(biao)，以伏(fu)馬(ma)毒素(su)濃(nong)度（ng /ml）的(de)半對數(shu)為(wei)橫坐標(biao)，繪制(zhi)標(biao)準曲(qu)線圖(tu)。將(jiang)樣(yang)本(ben)的百分(fen)吸光率代(dai)入(ru)標(biao)準曲(qu)線中(zhong)，從(cong)標(biao)準曲(qu)線上(shang)讀(du)出(chu)樣(yang)本(ben)所對(dui)應的(de)濃(nong)度，乘以(yi)其對應的(de)稀釋(shi)倍數(shu)即(ji)為(wei)樣(yang)本(ben)中伏(fu)馬(ma)毒素(su)實(shi)際(ji)含(han)量(liang)。

若(ruo)利(li)用(yong)試劑盒專業分(fen)析(xi)軟(ruan)件進行計(ji)算(suan)，更便(bian)於(yu)大量(liang)樣(yang)本(ben)的準(zhun)確、快速(su)分(fen)析(xi)。（歡(huan)迎(ying)來(lai)電索取）

3、 標(biao)準準(zhun)曲線：

B/B0 (%)

       0.5               1.5             4.5             13.5           40.5

 (ppb) [µg/kg]

圖(tu)1：伏(fu)馬(ma)毒素(su)檢(jian)測試劑盒的回歸(gui)曲(qu)線

4、再(zai)現性(xing)：

 %CV

      0        0.5     1.5     4.5    13.5    40.5 

(ppb) [µg/kg]

圖(tu)2：伏(fu)馬(ma)毒素(su)檢(jian)測試劑盒的(de)精(jing)密度(du)

由(you)多個(ge)不同(tong)的實(shi)驗結(jie)果確定(ding)了(le)精密(mi)度，圖(tu)2顯示出(chu)伏(fu)馬(ma)毒素(su)檢(jian)測試劑盒的(de)精(jing)密度(du)情況，獲(huo)得的標(biao)準吸(xi)收值的(de)變異系數(shu)（%CV）對(dui)相(xiang)應伏(fu)馬(ma)毒素(su)濃(nong)度作(zuo)曲線，可以看到在全部(bu)範圍(wei)內(nei)變(bian)異系數(shu)如(ru)此(ci)之(zhi)低(di)，可以得(de)到很好(hao)的(de)再(zai)現性(xing)。

【註(zhu)意(yi)事項(xiang)】   

1、 使用(yong)前(qian)將(jiang)所有(you)試劑溫度回升至(zhi)室(shi)溫20-25℃。試劑及標(biao)本沒有(you)回(hui)到室溫(wen)（20-25℃）會(hui)導(dao)致(zhi)所有(you)標(biao)準的(de)OD值偏低(di)。

2、 在(zai)洗(xi)板(ban)過(guo)程中(zhong)如(ru)果(guo)出(chu)現板(ban)孔幹(gan)燥(zao)的(de)情況，則(ze)會伴(ban)隨(sui)著(zhe)出(chu)現標(biao)準曲(qu)線不(bu)成(cheng)線性(xing)，重(zhong)復(fu)性(xing)不(bu)好(hao)的現象。所以(yi)洗(xi)板(ban)拍幹(gan)後應立即(ji)進(jin)行下壹(yi)步操(cao)作(zuo)。

3、 混(hun)合(he)要(yao)均(jun)勻，否則(ze)會出(chu)現重(zhong)復(fu)性(xing)不(bu)好(hao)的現象。

4、 反(fan)應終止液(ye)為(wei)2M硫(liu)酸(suan)，避免(mian)接觸皮膚。

5、 不(bu)要(yao)使用(yong)過(guo)了(le)有(you)效(xiao)日(ri)期(qi)的(de)試劑盒，稀釋(shi)或(huo)攙(chan)雜使用(yong)會(hui)引起(qi)靈敏度、OD值的(de)變化。不(bu)要(yao)交換(huan)使用(yong)不(bu)同(tong)批號(hao)的盒(he)中試劑。

6、 不(bu)用(yong)的(de)微(wei)孔板(ban)放(fang)進(jin)自封(feng)袋(dai)密(mi)封(feng)；標(biao)準物(wu)質(zhi)和(he)無色(se)的(de)發色劑對光敏感，因(yin)此(ci)要(yao)避(bi)免(mian)直(zhi)接(jie)暴露在光線下。

7、 顯色(se)液(ye)若(ruo)有(you)任(ren)何顏色表明(ming)變質(zhi)，應當(dang)棄(qi)之(zhi)。0標(biao)準的(de)吸光度值小於0.5個(ge)單位（A_450nm< 0.5 ）時(shi)，表(biao)示試劑可能(neng)變(bian)質。

8、 該試劑盒最佳(jia)反(fan)應溫(wen)度為(wei)25℃，溫(wen)度(du)過(guo)高或(huo)過(guo)低(di)將(jiang)導(dao)致檢測吸光度值和(he)靈(ling)敏度發(fa)生(sheng)變化(hua)。

【儲(chu)存】

原包裝應儲(chu)存於2～8℃保鮮冷藏，切(qie)勿(wu)冷凍。

【有(you)效(xiao)期(qi)】

有(you)效(xiao)期(qi)12個(ge)月;生(sheng)產日(ri)期(qi)、有(you)效(xiao)期(qi)、生(sheng)產批(pi)號(hao)見外(wai)包(bao)裝。