黃(huang)曲(qu)黴(mei)毒(du)素(su)M1快(kuai)速(su)檢測(ce)試劑盒(he)說明書(shu)

   黃(huang)曲(qu)黴(mei)毒(du)素(su)M1快(kuai)速(su)檢測(ce)試劑盒(he)

使用說明書(shu)

黃(huang)曲(qu)黴(mei)毒(du)素(su)是(shi)壹類(lei)真(zhen)菌（如黃(huang)曲(qu)黴(mei)和(he)寄(ji)生曲黴(mei)）的(de)有(you)毒(du)的(de)代謝(xie)產(chan)物(wu)，它們(men)具有(you)很(hen)強的(de)致(zhi)癌(ai)性(xing)，主(zhu)要(yao)存在(zai)於谷物(wu)、堅(jian)果、棉(mian)籽(zi)以及壹些(xie)和(he)人(ren)類(lei)血(xue)液，動物(wu)飼(si)料相關(guan)的(de)產(chan)品(pin)中(zhong)。其中黃(huang)曲(qu)黴(mei)毒(du)素(su)M1（AFM1）的(de)毒性(xing)、致(zhi)癌(ai)性(xing)、汙染頻率(lv)均居(ju)於首wei。薄層色譜(pu)壹直(zhi)是(shi)檢(jian)測(ce)黃(huang)曲(qu)黴(mei)毒(du)素(su)常用的(de)方法(fa)，但是(shi)此(ci)方法(fa)制備樣品及分(fen)析(xi)樣(yang)品時費時又(you)費(fei)力。而使(shi)用黃(huang)曲(qu)黴(mei)毒(du)素(su)M1 ELISA試劑盒(he)則(ze)能(neng)夠(gou)快(kuai)速(su)而準(zhun)確的(de)分析(xi)樣(yang)品中黃(huang)曲(qu)黴(mei)毒(du)素(su)M1殘留。參(can)考國(guo)家(jia)標準(zhun)GB/T 5009.22-2003。

本試劑盒(he)采(cai)用間接(jie)競(jing)爭ELISA方法(fa)，在(zai)微(wei)孔(kong)條上(shang)預包(bao)被(bei)偶(ou)聯(lian)抗(kang)原，樣(yang)本中的(de)殘留物(wu)黃(huang)曲(qu)黴(mei)毒(du)素(su)M1和(he)微(wei)孔(kong)條(tiao)上(shang)預包(bao)被(bei)的(de)偶(ou)聯(lian)抗(kang)原競(jing)爭黃(huang)曲(qu)黴(mei)毒(du)素(su)M1抗(kang)體，加入酶標記物(wu)後(hou)，用TMB底物(wu)顯色，樣本吸(xi)光(guang)值(zhi)與(yu)其(qi)所(suo)含(han)殘留物(wu)黃(huang)曲(qu)黴(mei)毒(du)素(su)M1的(de)含量(liang)成(cheng)負相關(guan)，與(yu)標準(zhun)曲(qu)線(xian)比較可得(de)出(chu)相應殘留物(wu)黃(huang)曲(qu)黴(mei)毒(du)素(su)M1的(de)含量(liang)。

規(gui)       格：96孔/盒(he)

靈 敏 度： 0.025ppb

檢測(ce)時間： 45min

樣本檢測(ce)下(xia)限(xian)：

牛奶……………………………………………0.25ppb

奶粉、奶油、奶酪……………………………0.025ppb

飼(si)料……………………………………………2.5ppb

反應率(lv)：

黃(huang)曲(qu)黴(mei)毒(du)素(su)M1……………………………………100%

回收率(lv)：

食    品…………………………………………85±10%

飼(si)    料…………………………………………75±10%

【試劑盒(he)組成(cheng)】   

1、 微量(liang)測(ce)試孔：（1X96孔板(ban)）每條(tiao)8孔，壹板(ban)12條

1、 標準(zhun)液X6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、0.025ppb、0.075ppb、0.225ppb、0.675ppb、2.025ppb

2、 高(gao)濃度(du)標準(zhun)品(pin)：×1瓶：（1ml/瓶） 10ppb

2、 酶標記物(wu)      7ml…………………………紅色帽(mao)

3、 抗(kang)體工(gong)作(zuo)液     7ml…………………………綠色帽(mao)

4、 底物(wu)液 A液    7ml…………………………棕(zong)色帽(mao)

5、 底物(wu)液 B液    7ml…………………………黑色帽(mao)

6、 終(zhong) 止(zhi) 液          7ml…………………………黃(huang)色帽(mao)

7、 20X濃縮(suo)洗(xi)滌液40ml…………………… 白色帽(mao)

8、 2X濃縮(suo)復(fu)溶(rong)液50 ml…………………藍色帽(mao)

【所用儀器、試劑】   

儀          器：微(wei)孔板酶標儀450nm/630nm、旋轉(zhuan)蒸發儀/

                     氮(dan)氣(qi)吹(chui)幹裝(zhuang)置(zhi)、均質器、振蕩器(qi)、離心(xin)機、

                     刻度移液管、天(tian)平（感量0.01g ）

微量(liang)移液器：單道 20µl～200µl、100µl～1000µl、多(duo)道 250µl

試           劑：甲醇、正己(ji)烷(wan)、濾紙

【實驗前溶(rong)液配制】

配液1、50%甲醇溶(rong)液：

 50ml蒸餾(liu)水(shui)或去離子水(shui)和(he)50ml純甲(jia)醇混(hun)合制備50％甲醇

溶(rong)液。

配液2、將2×濃縮(suo)復(fu)溶(rong)液用去離子水(shui)按(an)照1：1稀釋(shi)（1份(fen)濃(nong)縮(suo)復(fu)

溶(rong)液+1份(fen)去離子水(shui)）用於樣品(pin)的(de)稀釋(shi)。

配液3、將40ml濃縮(suo)洗(xi)滌液（20倍濃(nong)縮(suo)）用去離子水(shui)按(an)照1：19

稀釋(shi)（1份(fen)濃(nong)縮(suo)洗(xi)滌液+19份(fen)去離子水(shui)），或按(an)所需(xu)用量

配制洗滌液。

【樣本前處理步(bu)驟】   

處理(li)任(ren)何(he)樣(yang)本時，都必(bi)須註意(yi)：

（1）實驗中必(bi)須使用壹次(ci)性(xing)吸(xi)頭，在(zai)吸(xi)取(qu)不同試劑時要更換(huan)吸(xi)頭

（2）實驗之(zhi)前(qian)須檢查(zha)實驗器具(ju)是(shi)否幹凈(jing)，必(bi)要時可對實驗器具(ju)進(jin)行清(qing)潔(jie)，以(yi)避(bi)免汙染幹擾實驗結(jie)果(guo)。

（a）生鮮牛奶；

     1、直接(jie)取(qu)50µl牛奶+450µl已(yi)經稀釋(shi)後(hou)的(de)復(fu)溶(rong)液混(hun)合30s；

     2、取(qu)50µl用於檢測(ce)檢(jian)測(ce)分析(xi)。

          樣本稀釋(shi)倍(bei)數:10

（b）奶粉、奶油、奶酪

1、稱(cheng)取(qu)5g樣品(pin)於50ml離心(xin)管中(zhong)，加(jia)入10ml甲醇，強力(li)振蕩5min；室溫(wen)4000r/min以上(shang)，離心(xin)10min。

2、取(qu)2ml上(shang)清(qing)液，於50℃水(shui)浴中(zhong)氮(dan)氣(qi)/空氣(qi)吹(chui)幹。

3、用1ml正己(ji)烷(wan)溶(rong)解殘留物(wu)，加入1ml已(yi)經稀釋(shi)後(hou)的(de)復(fu)溶(rong)液混(hun)合30s；室溫(wen)4000r/min以上(shang)，離心(xin)5min，

4、取(qu)50ul下層溶(rong)液進(jin)行檢測(ce)分析(xi)。

     樣本稀釋(shi)倍(bei)數:1

（C）飼(si)料

1、稱(cheng)取(qu)2g粉碎的(de)樣品(pin)於50ml離心(xin)管中(zhong)，加(jia)入10ml 的(de)50%甲醇溶(rong)液混(hun)合；強力振蕩5分鐘。

2、用Whatman No.濾紙過濾(lv)；收集過濾(lv)液。

3、取(qu)出上(shang)清(qing)液50ul與(yu)已(yi)經稀釋(shi)後(hou)的(de)復(fu)溶(rong)液950ul 充分(fen)混(hun)合30s

      取(qu)50ul進(jin)行檢測(ce)分析(xi)。

          樣本稀釋(shi)倍(bei)數:100

【酶標免疫分(fen)析(xi)程序】

操作(zuo)步(bu)驟：

1、 將所(suo)需試劑從(cong)冷(leng)藏環(huan)境(jing)中(zhong)取(qu)出，置室(shi)溫(wen)（20-25℃）平衡(heng)30min以上(shang)，註意(yi)每種液體試劑使(shi)用前均須搖勻(yun)。

2、 按(an)板架(jia)及需(xu)要(yao)取(qu)出微孔(kong)條(tiao)，將(jiang)不用的(de)微孔(kong)放入自封袋，保存於2-8℃。

3、 編號(hao)：將樣本和(he)標準(zhun)品(pin)對(dui)應微(wei)孔(kong)按(an)序編(bian)號(hao)每個(ge)樣本和(he)標準(zhun)品(pin)做(zuo)2孔平(ping)行，並記錄(lu)標準(zhun)孔(kong)和(he)樣(yang)本孔所在(zai)的(de)位(wei)置。

4、 加標準(zhun)品(pin)/樣本50µl /孔，然(ran)後(hou)加(jia)酶標記物(wu)50μl/孔，再加(jia)入抗(kang)體工(gong)作(zuo)液50µl/孔。輕(qing)輕(qing)振蕩混(hun)勻，用蓋(gai)板(ban)膜蓋(gai)板(ban)，25℃環境(jing)反應30min。

5、 取(qu)出將孔(kong)內液體甩幹，用洗液250µl/孔洗(xi)板4-5次(ci)，每(mei)次(ci)間隔15-30秒(miao)，用吸(xi)水(shui)紙拍幹（拍幹後(hou)未(wei)被(bei)清(qing)除(chu)的(de)氣(qi)泡(pao)可用幹凈(jing)的(de)槍頭刺(ci)破(po)）。

6、  顯色：每孔(kong)加(jia)入A液50µl，再加(jia)B液50µl，輕(qing)輕(qing)振蕩混(hun)勻，25℃環境(jing)中避(bi)光顯色15min。

7、 測(ce)定：每孔加入終(zhong)止(zhi)液50µl，輕(qing)輕(qing)振蕩，設(she)定酶標儀於450nm處（建(jian)議用雙波(bo)長450/630nm檢測(ce),在(zai)5min內讀(du)完(wan)數據(ju)）測(ce)定吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)（OD值(zhi)）。

【結(jie)果(guo)判定】

結(jie)果(guo)判定有(you)兩(liang)種方(fang)法(fa)，粗略判定可用第1種方(fang)法(fa)，定量判定用第2種方(fang)法(fa)。註意(yi)樣本吸(xi)光(guang)值(zhi)與(yu)黃(huang)曲(qu)黴(mei)毒(du)素(su)M1的(de)含量(liang)成(cheng)負相關(guan)。

1、粗略判定：

用樣品(pin)的(de)平均吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)與(yu)標準(zhun)值(zhi)比較即(ji)可得(de)出(chu)樣本所含M1濃度(du)範圍（ng/ml）。假設樣品1的(de)吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)為(wei)0.248，樣品2的(de)吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)為(wei)1.021，標準(zhun)液吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)分別(bie)是(shi)：0ppb為(wei)1.821；0.025ppb為(wei)1.434；0.075ppb為(wei)1.163； 0.225ppb為(wei)0.767； 0.675ppb為(wei)0.298； 2.025ppb為(wei)0.106。則(ze)樣(yang)品(pin)1的(de)濃度(du)範(fan)圍0.675ppb-2.025ppb；樣品(pin)2的(de)濃度(du)範(fan)圍0.075ppb-0.0.225ppb。乘以其(qi)對(dui)應的(de)稀釋(shi)倍(bei)數即(ji)為(wei)樣本中黃(huang)曲(qu)黴(mei)毒(du)素(su)M1的(de)實際(ji)含量(liang)。

2、定量判定：

所獲(huo)得(de)的(de)每個(ge)濃度(du)標準(zhun)溶(rong)液和(he)樣(yang)本吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)的(de)平均值(zhi)（B）除以(yi)第壹個(ge)標準(zhun)（0標準(zhun)）的(de)吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)（B₀）再乘以100%，即(ji)百(bai)分(fen)吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)。

B—標準(zhun)溶(rong)液或樣(yang)本溶(rong)液的(de)平均吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)

B₀—0ng/ml標準(zhun)溶(rong)液的(de)平均吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)

以標準(zhun)品(pin)百(bai)分(fen)吸(xi)光(guang)率(lv)為(wei)縱坐(zuo)標，以黃(huang)曲(qu)黴(mei)毒(du)素(su)M1標準(zhun)品(pin)濃(nong)度（ng/ml）的(de)半(ban)對(dui)數為(wei)橫坐(zuo)標，繪(hui)制(zhi)標準(zhun)曲(qu)線(xian)圖(tu)。將(jiang)樣本的(de)百(bai)分(fen)吸(xi)光(guang)率(lv)代入標準(zhun)曲(qu)線(xian)中，從(cong)標準(zhun)曲(qu)線(xian)上(shang)讀出(chu)樣本所對應的(de)濃度(du)，乘以其(qi)對(dui)應的(de)稀釋(shi)倍(bei)數即(ji)為(wei)樣本中黃(huang)曲(qu)黴(mei)毒(du)素(su)M1實際(ji)濃度(du)。

若利(li)用試劑盒(he)專(zhuan)業分(fen)析軟(ruan)件(jian)進(jin)行計(ji)算(suan)，更便於大(da)量樣(yang)品的(de)準(zhun)確、快(kuai)速(su)分析(xi)。

3、標準(zhun)準(zhun)曲(qu)線(xian)：

B/B0 (%)

       0.025     0.075       0.225     0.675     2.025

                    黃(huang)曲(qu)黴(mei)毒(du)素(su)M1(ppb) [µg/kg]

圖(tu)1：黃(huang)曲(qu)黴(mei)毒(du)素(su)M1檢測(ce)試劑盒(he)的(de)回歸(gui)曲線(xian)

4、再現性(xing)：

%CV

         0      0.025    0.075     0.225   0.675   2.025

黃(huang)曲(qu)黴(mei)毒(du)素(su)M1 (ppb) [µg/kg]

圖(tu)2：黃(huang)曲(qu)黴(mei)毒(du)素(su)M1檢測(ce)試劑盒(he)的(de)精密(mi)度(du)

由多(duo)個(ge)不同的(de)實驗結(jie)果(guo)確定了精密(mi)度(du)，圖(tu)2顯示(shi)出(chu)黃(huang)曲(qu)黴(mei)毒(du)素(su)M1檢測(ce)試劑盒(he)的(de)精密(mi)度(du)情況，獲得(de)的(de)標準(zhun)吸(xi)收值(zhi)的(de)變(bian)異系數（%CV）對相應黃(huang)曲(qu)黴(mei)毒(du)素(su)M1濃度(du)作曲線，可以看(kan)到在(zai)全部(bu)範(fan)圍內變(bian)異系數如(ru)此(ci)之(zhi)低，可以得(de)到很好的(de)再現性(xing)。

【註意(yi)事項(xiang)】

1、 使用前將(jiang)所(suo)有(you)試劑溫(wen)度回升至(zhi)室(shi)溫(wen)20-25℃。試劑及標本沒(mei)有(you)回到室溫(wen)（20-25℃）會(hui)導致(zhi)所有(you)標準(zhun)的(de)OD值(zhi)偏低。

2、 在(zai)洗(xi)板(ban)過程中如(ru)果出(chu)現板(ban)孔幹燥(zao)的(de)情況，則(ze)會(hui)伴隨(sui)著出現標準(zhun)曲(qu)線(xian)不成(cheng)線性(xing)，重(zhong)復(fu)性(xing)不好的(de)現象(xiang)。所(suo)以(yi)洗(xi)板(ban)拍幹後(hou)應立即(ji)進(jin)行下(xia)壹步(bu)操作(zuo)。

3、 混(hun)合要均勻(yun)，否則(ze)會(hui)出現重(zhong)復(fu)性(xing)不好的(de)現象(xiang)。

4、 反應終(zhong)止(zhi)液為(wei)2M硫酸(suan)，避(bi)免接(jie)觸(chu)皮膚(fu)。

5、 不要(yao)使用過了(le)有(you)效日(ri)期(qi)的(de)試劑盒(he)，稀釋(shi)或(huo)攙(chan)雜(za)使(shi)用會(hui)引起靈敏度(du)、OD值(zhi)的(de)變(bian)化(hua)。不要(yao)交換(huan)使用不同批(pi)號的(de)盒(he)中試劑。

6、 不用的(de)微孔(kong)板(ban)放進(jin)自封袋密封；標準(zhun)物(wu)質和(he)無(wu)色的(de)發色劑對(dui)光(guang)敏感，因此(ci)要避(bi)免直(zhi)接(jie)暴露在(zai)光(guang)線(xian)下。

7、 顯色液若有(you)任(ren)何(he)顏(yan)色表明(ming)變(bian)質，應當(dang)棄(qi)之(zhi)。0標準(zhun)的(de)吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)小於0.5個(ge)單位(wei)（A_450nm< 0.5 ）時，表示(shi)試劑可能變(bian)質。

8、 該試劑盒(he)最佳(jia)反(fan)應溫(wen)度為(wei)25℃，溫(wen)度過高(gao)或過低將導(dao)致(zhi)檢測(ce)吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)和(he)靈敏度(du)發生變(bian)化(hua)。

【儲(chu)存(cun)】原包(bao)裝應儲(chu)存(cun)於2～8℃保鮮冷(leng)藏，切勿(wu)冷(leng)凍。

【有(you)效期(qi)】有(you)效期(qi)12個(ge)月;生產(chan)日(ri)期(qi)、有(you)效期(qi)、批(pi)號見(jian)外包(bao)裝。