諾氟沙星ELISA檢(jian)測試(shi)劑盒說明(ming)書(shu)

                           諾氟沙星快(kuai)速(su)檢(jian)測試(shi)劑盒

                                     使用說(shuo)明(ming)書(shu)

【原(yuan)理(li)】

試(shi)劑盒采用(yong)間(jian)接競(jing)爭(zheng)ELISA方(fang)法，在微孔條上(shang)預(yu)包(bao)被(bei)偶聯(lian)抗(kang)原(yuan)，樣(yang)本中的(de)殘留物(wu)諾氟沙星和(he)微孔條上(shang)預(yu)包(bao)被(bei)的(de)偶聯(lian)抗(kang)原(yuan)競(jing)爭抗諾氟沙星抗(kang)體，加(jia)入(ru)酶(mei)標(biao)記物(wu)後，用(yong)TMB底(di)物(wu)顯色，樣本(ben)吸光值(zhi)與其所含(han)殘(can)留諾氟沙星的(de)含量(liang)成負(fu)相關，與(yu)標(biao)準(zhun)曲(qu)線比較(jiao)即(ji)可得出相應(ying)殘留物(wu)諾氟沙星的(de)含量(liang)。

【試(shi)劑盒技術指標】   

規(gui)       格(ge)：96孔(kong)/盒(he)

靈 敏(min) 度： 0.1ppb

檢(jian)測時(shi)間(jian)： 45min

樣(yang)本(ben)定(ding)量(liang)檢(jian)測下(xia)限(xian)：  

組(zu)   織(zhi)………………………………………0.1ppb

蜂   蜜(mi)………………………………………0.2ppb

血(xue)   清(qing)………………………………………0.2ppb

樣(yang)本(ben)回收率

組(zu)   織(zhi)…………………………………80±15%

血(xue)   清(qing)…………………………………80±15%

蜂   蜜(mi) ……………………………… 75±15%

諾氟沙星反(fan)應(ying)率

諾氟沙星（ENR）………………………100％

【試(shi)劑盒組(zu)成(cheng)】   

1、 微量測試(shi)孔：每條8孔(kong)，壹(yi)板(ban)12條

2、 標(biao)準(zhun)液×6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb

3、 高(gao)濃度標(biao)準(zhun)品(pin)溶液×1瓶：（1ml/瓶）100ppb

4、 酶(mei)標(biao)記物(wu)               7ml……………………………紅色(se)帽(mao)

5、 抗(kang)體工(gong)作(zuo)液(ye)          7ml……………………………綠(lv)色(se)帽(mao)

6、 底(di)物(wu)A液(ye)              7ml……………………………棕(zong)色(se)帽(mao)

7、 底(di)物(wu)B液(ye)　          7ml……………………………黑(hei)色(se)帽(mao)

8、 終(zhong)止液                  7ml……………………………黃(huang)色(se)帽(mao)

9、 20X濃(nong)縮(suo)洗(xi)滌(di)液40ml ……………………………白色帽(mao)

10、 2X濃(nong)縮(suo)復(fu)溶(rong)液(ye)   50 ml ……………………………藍色帽

【所(suo)用(yong)儀(yi)器、試(shi)劑】   

具(ju)備(bei)的(de)儀(yi)器：微孔酶(mei)標(biao)儀(yi)、打(da)印機(ji)、均(jun)質器(qi) 、氮(dan)氣吹幹(gan)裝(zhuang)置(zhi)、振(zhen)蕩(dang)器(qi)、離(li)心(xin)機(ji)、刻(ke)度移(yi)液(ye)管(guan)、天(tian)平(ping)（感(gan)量(liang)0.01g）

微量移(yi)液器(qi)：單道20µl-200µl、100µl-1000µl，多道(dao)250µl

試(shi)         劑：濃(nong)鹽(yan)酸、二(er)氯(lv)甲(jia)烷(wan)、正(zheng)己烷(wan)、乙腈(jing)、肝(gan)素(su)鈉(na)

                     Na₂HPO₄·12H₂O、NaH₂PO₄·2H₂O、

【實(shi)驗(yan)前(qian)溶(rong)液(ye)配(pei)制(zhi)】

樣(yang)本(ben)處理前(qian)需配(pei)制(zhi)：

配(pei)液(ye)1、0.1M HCL溶(rong)液(ye)  

860µl濃(nong)鹽(yan)酸加(jia)去離(li)子水(shui)100ml溶(rong)解。

配(pei)液(ye)2、乙腈(jing)-0.1MHCL溶(rong)液(ye)

V_乙腈(jing)：V_{0.1M –HCL} ＝ 84：16

配(pei)液(ye)3、乙腈(jing)-二(er)氯(lv)甲(jia)烷(wan)混(hun)合(he)溶(rong)液(ye)

V_乙腈(jing)-V_{二(er)氯(lv)甲(jia)烷(wan)}  =  1 : 4

配(pei)液(ye)4、pH7.2  0.05M PB緩(huan)沖液

12.9gNa₂HPO₄·12H₂O+2.175gNaH₂PO₄·2H₂O

             加(jia)去離(li)子水(shui)1L溶(rong)解。

配(pei)液(ye)5、pH7.2   0.02MPB緩(huan)沖液

 5.16gNa₂HPO₄·12H₂O+0.87g NaH₂PO₄·2H₂O

 加(jia)去離(li)子水(shui)1L溶(rong)解。

配(pei)液(ye)6、用(yong)去離(li)子水(shui)將(jiang)2X濃(nong)縮(suo)復(fu)溶(rong)液(ye)按1：1稀(xi)釋

（1份(fen)濃縮(suo)復溶(rong)液+1份(fen)去離(li)子水(shui)）用(yong)於樣(yang)本(ben)復(fu)溶。

配(pei)液(ye)7、將(jiang)40ml濃(nong)縮(suo)洗(xi)滌(di)液（20倍濃(nong)縮(suo)）用(yong)去離(li)子水(shui)按(an)照(zhao)1：19稀(xi)釋

        （1份(fen)濃縮(suo)洗(xi)滌(di)液+19份(fen)去離(li)子水(shui)），或按(an)所需用量配(pei)制(zhi)洗(xi)滌(di)液。

【樣(yang)本(ben)前(qian)處理方(fang)法】   

樣(yang)本(ben)前(qian)處理須(xu)知(zhi)：處理任何樣本(ben)時(shi)，都(dou)必(bi)須(xu)註(zhu)意(yi)：

（a）本(ben)試(shi)劑盒所檢(jian)測的(de)組(zu)織(zhi)樣本(ben)包(bao)括：動物(wu)組(zu)織(zhi)、

禽(qin)類(lei)和(he)水(shui)產(chan)組(zu)織(zhi)。eg:雞、鴨(ya)、牛(niu)、兔(tu)、魚、蝦等。

（b）實(shi)驗(yan)中(zhong)必(bi)須(xu)使用壹(yi)次(ci)性吸頭，在吸取不(bu)同(tong)的(de)試(shi)劑時(shi)要(yao)更換(huan)吸頭。

（c）實(shi)驗(yan)之(zhi)前(qian)須(xu)檢(jian)查(zha)各種(zhong)實驗(yan)器具(ju)是否(fou)幹(gan)凈(jing)，必(bi)要(yao)時(shi)可對實驗(yan)器(qi)具進(jin)行(xing)清(qing)潔(jie)，以(yi)避(bi)免(mian)汙(wu)染幹(gan)擾實(shi)驗(yan)結(jie)果(guo)。

樣(yang)本(ben)前(qian)處理步(bu)驟

（a）組(zu)織(zhi)樣本(ben)（雞肉(rou)/肝(gan)、豬(zhu)肉(rou)/肝(gan)、蝦(xia)、魚等）

1、 稱(cheng)2.0±0.05g 均(jun)質的(de)組(zu)織(zhi)樣本(ben)於50ml離(li)心(xin)管中(zhong)；

2、 加(jia)入(ru)乙腈(jing)-二(er)氯(lv)甲(jia)烷(wan)混(hun)合(he)溶(rong)液(ye)8ml，振(zhen)蕩(dang)5min，4000r/min以(yi)上(shang)，15℃離(li)心(xin)10min；

3、 取(qu)4ml上(shang)層(ceng)清澈有(you)機(ji)相至(zhi)幹(gan)燥(zao)溶(rong)器(qi)中，56℃氮(dan)氣吹幹(gan)/旋轉蒸(zheng)發(fa)至(zhi)幹(gan)；

4、 用(yong)1ml稀(xi)釋後的(de)復溶(rong)液溶(rong)解幹(gan)燥(zao)的(de)殘留物(wu)，加(jia)入(ru)正(zheng)己烷(wan)1ml混(hun)合(he)30s，4000r/min以(yi)上(shang)，15℃離(li)心(xin)5min；

5、 去除上(shang)層(ceng)取下(xia)層(ceng)50µl液(ye)體用(yong)於分(fen)析(xi)。

         樣(yang)本(ben)稀(xi)釋倍數：1

（b）血(xue)清(qing)樣(yang)本(ben)的(de)處理

1、 用(yong)加(jia)有(you)肝素(su)鈉(na)（20-30單位(wei)/ml血(xue)）的(de)離心(xin)管采集血樣(yang)本（建議(yi)采血(xue)註(zhu)射(she)器也(ye)用(yong)肝素(su)鈉(na)潤(run)洗(xi)），血(xue)樣本室(shi)溫(wen)靜(jing)置(zhi)1h，待(dai)析(xi)出血(xue)漿(jiang)後4000r/min以(yi)上(shang)，15℃離(li)心(xin)10min，取(qu)出血(xue)漿(jiang)1ml；

2、 加(jia)入(ru)乙腈(jing)（無水(shui)）4ml上(shang)下(xia)充(chong)分混(hun)合(he)5min，4000r/min以(yi)上(shang)，15℃離(li)心(xin)10min；

3、 移(yi)上(shang)清(qing)至(zhi)另(ling)壹離(li)心(xin)管中(zhong)，加(jia)入(ru)2ml 0.02M PB緩(huan)沖液，混(hun)勻(yun)；

4、 加(jia)入(ru)二氯(lv)甲(jia)烷(wan)5ml，充(chong)分混(hun)勻(yun)5min，4000r/min，15℃離(li)心(xin)10min，去上(shang)層(ceng)，取下(xia)層(ceng)有(you)機(ji)相到(dao)幹(gan)燥(zao)瓶

        中(zhong)（清(qing)亮(liang)無雜質），50℃旋轉蒸(zheng)發(fa)至(zhi)幹(gan)/氮(dan)氣吹幹(gan)；

5、 用(yong)1ml稀(xi)釋後的(de)復溶(rong)液(ye)溶(rong)解幹(gan)燥(zao)的(de)殘留物(wu)，加(jia)入(ru)正(zheng)

        己(ji)烷(wan)1ml混(hun)合(he)30s，4000r/min以(yi)上(shang)，離(li)心(xin)5min；

6、 輕吸掉(diao)上(shang)層(ceng)和中(zhong)間(jian)白色雜質，取(qu)下(xia)層(ceng)相100µl加(jia)入(ru)100µl稀(xi)釋後的(de)復溶(rong)液，混(hun)合(he)30s；

7、 取(qu)50µl用(yong)於分(fen)析(xi)。

        樣(yang)本(ben)稀(xi)釋倍數：2

（c）蜂蜜(mi)

1、 取(qu)1g蜂蜜(mi)，加(jia)６ml乙腈(jing)-0.1MHCL溶液(ye)振(zhen)蕩(dang)至(zhi)蜂蜜(mi)全部(bu)溶解；

2、 加(jia)入(ru)３ml 0.05M PB緩(huan)沖液，加(jia)入(ru)11ml二氯(lv)甲(jia)烷(wan)，振(zhen)蕩(dang)5min，4000r/min以(yi)上(shang)離(li)心(xin)5min；

3、 輕吸掉(diao)上(shang)層(ceng)，取下(xia)層(ceng)有(you)機(ji)相８ml至(zhi)幹(gan)燥(zao)溶(rong)器(qi)中，56℃氮(dan)氣吹幹(gan)；

4、 用(yong)1ml稀(xi)釋後的(de)復溶(rong)液溶(rong)解幹(gan)燥(zao)的(de)殘留物(wu)，再(zai)加(jia)入(ru)正(zheng)己烷(wan)1ml混(hun)合(he)30s，3000r/min以(yi)上(shang)，15℃離(li)心(xin)5min；

5、 去除上(shang)層(ceng)取下(xia)層(ceng)50µl液(ye)體用(yong)於分(fen)析(xi)。

        稀(xi)釋倍數：2

註(zhu)：在使用國家(jia)規(gui)定(ding)最(zui)高(gao)殘留xian量(liang)（100ppb）進(jin)行(xing)判(pan)定(ding)時(shi)，需進(jin)行(xing)10倍稀(xi)釋（1份(fen)樣本(ben)液+9份(fen)已(yi)稀釋好(hao)的(de)復溶(rong)液(ye)）。

【酶(mei)標(biao)免(mian)疫分(fen)析(xi)程(cheng)序(xu)】   

操(cao)作(zuo)步(bu)驟(zhou)：

1、 將(jiang)試(shi)劑盒從冷(leng)藏(zang)環境(jing)中取(qu)出並(bing)將所需試(shi)劑從試(shi)劑盒取出，置(zhi)室溫(wen)（20-25℃）平(ping)衡(heng)30min以(yi)上(shang), 註(zhu)意(yi)每種(zhong)液體試(shi)劑使用前(qian)均(jun)須(xu)搖(yao)勻(yun)。

2、 按(an)需(xu)要(yao)取出微孔條及板架，將不(bu)用的(de)微孔板(ban)重(zhong)新(xin)密封(feng)，保(bao)存(cun)於2-8℃，不(bu)要(yao)冷(leng)凍。

3、 編(bian)號：將(jiang)樣本(ben)和標準(zhun)品(pin)對應(ying)微孔按(an)序(xu)編號，每個(ge)樣(yang)本(ben)和標(biao)準(zhun)品(pin)均需做2孔(kong)平(ping)行(xing)，並(bing)記錄(lu)標(biao)準(zhun)孔的(de)樣本(ben)孔所(suo)在的(de)位(wei)置(zhi)。

4、 加(jia)標(biao)準(zhun)品(pin)/樣(yang)本(ben)50µl /孔(kong)，然(ran)後加(jia)入(ru)50µl/孔(kong)酶(mei)標(biao)記物(wu)；再(zai)加(jia)入(ru)50µl/孔(kong)抗(kang)體工(gong)作(zuo)液(ye)。輕輕振(zhen)蕩(dang)混(hun)勻(yun)，用蓋(gai)板(ban)膜(mo)蓋(gai)板(ban)，25℃環(huan)境(jing)反(fan)應(ying)30min。

5、 取(qu)出用(yong)洗(xi)滌(di)液按每孔(kong)250μl洗(xi)板(ban)4-5次(ci)，每次(ci)浸(jin)泡(pao)15-30秒(miao)，拍(pai)幹(gan)（拍(pai)幹(gan)後未(wei)被(bei)清除的(de)氣泡可用幹(gan)凈(jing)的(de)槍頭刺(ci)破(po)）。

6、 顯色：每孔(kong)加(jia)入(ru)底(di)物(wu)液(ye)A液(ye)50µl再(zai)加(jia)B液(ye)50µl，輕輕振(zhen)蕩(dang)混(hun)勻(yun)，25℃環(huan)境(jing)避光顯色15min。

7、 測定(ding)：每孔(kong)加(jia)入(ru)終止液50µl，輕輕振(zhen)蕩(dang)混(hun)勻(yun)，設定酶標儀(yi)於450nm處（建議(yi)用雙波長(chang)450/630nm檢(jian)測在5min內(nei)讀(du)完(wan)數據），測定(ding)吸光度值(zhi)（OD值(zhi)）。

【結(jie)果(guo)判定】   

結(jie)果(guo)判定有(you)兩種(zhong)方法，粗(cu)略(lve)判(pan)定(ding)可用第(di)1種(zhong)方法，定量判(pan)定用(yong)第(di)2種(zhong)方法。註(zhu)意(yi)樣(yang)本(ben)吸光值(zhi)與諾氟沙星的(de)含量(liang)成負(fu)相關。

1、粗(cu)略(lve)判(pan)定(ding)

用(yong)樣(yang)本(ben)的(de)平(ping)均(jun)吸光度值(zhi)與(yu)標(biao)準(zhun)品(pin)比較(jiao)即(ji)可得出其濃度範(fan)圍(wei)(ng/ml)。假(jia)設樣本1的(de)吸光度值(zhi)為(wei)0.238， 樣(yang)本(ben)2的(de)吸光度值(zhi)為(wei)0.946，標(biao)準(zhun)液吸光度值(zhi)分(fen)別(bie)是：0ppb為(wei)1.845； 0.1ppb為(wei)1.542；0.3ppb為(wei)1.130； 0.9ppb為(wei)0.635；2.7ppb為(wei)0.326； 8.1ppb為(wei)0.156。則(ze)樣(yang)本(ben)1的(de)濃度範(fan)圍(wei)是2.7ppb-8.1ppb；樣(yang)本(ben)2的(de)濃度範(fan)圍(wei)是0.3ppb-0.9ppb。乘(cheng)以(yi)其對應(ying)的(de)稀釋倍數即(ji)為(wei)樣(yang)本中諾氟沙星的(de)實際(ji)濃度。

2、定(ding)量(liang)分(fen)析(xi)

（1）百分吸光率的(de)計算(suan)，標(biao)準(zhun)品(pin)或樣(yang)本的(de)百分吸光率等(deng)於標(biao)準(zhun)品(pin)或樣(yang)本的(de)百分吸光度值(zhi)的(de)平(ping)均(jun)值(zhi)（雙孔）除以(yi)第(di)壹個標(biao)準(zhun)（0標(biao)準(zhun)）的(de)吸光度值(zhi)，再(zai)乘(cheng)以(yi)100%，即(ji)

B—標(biao)準(zhun)溶液(ye)或樣(yang)本溶液的(de)平(ping)均(jun)吸光度值(zhi)

B₀—0ng/ml標(biao)準(zhun)溶液(ye)的(de)平(ping)均(jun)吸光度值(zhi)

（2）標(biao)準(zhun)曲(qu)線的(de)繪制(zhi)與(yu)計(ji)算(suan)

以(yi)標(biao)準(zhun)品(pin)百分吸光率為(wei)縱(zong)坐(zuo)標，以(yi)諾氟沙星標(biao)準(zhun)品(pin)濃度（ng/ml）的(de)半對數為橫(heng)坐(zuo)標，繪制(zhi)標(biao)準(zhun)曲(qu)線圖(tu)。將(jiang)樣(yang)本的(de)百分(fen)吸光率代(dai)入標準(zhun)曲(qu)線中(zhong)，從(cong)標(biao)準(zhun)曲(qu)線上(shang)讀(du)出樣(yang)本所對應(ying)的(de)濃度，乘(cheng)以(yi)其對應(ying)的(de)稀釋倍數即(ji)為(wei)樣(yang)本中諾氟沙星的(de)實際(ji)濃度。

若(ruo)利(li)用(yong)試(shi)劑盒專業分(fen)析(xi)軟(ruan)件進(jin)行(xing)計(ji)算(suan)，更(geng)便(bian)於大(da)量(liang)樣本的(de)準(zhun)確、快(kuai)速(su)分(fen)析(xi)。（歡迎(ying)來電(dian)索(suo)取）

由多個(ge)不(bu)同(tong)的(de)實驗(yan)結(jie)果(guo)確定(ding)了精密度，圖(tu)2顯示(shi)出諾氟沙星檢(jian)測試(shi)劑盒的(de)精密度情(qing)況(kuang)，獲(huo)得的(de)標準(zhun)吸收值的(de)變(bian)異(yi)系數（%CV）對相應(ying)諾氟沙星濃(nong)度作(zuo)曲(qu)線，可以(yi)看(kan)到(dao)在全部(bu)範圍(wei)內(nei)變(bian)異(yi)系數如(ru)此(ci)之低(di)，可以(yi)得(de)到(dao)很(hen)好(hao)的(de)再現(xian)性。

【註(zhu)意(yi)事(shi)項(xiang)】   

6、 使用前(qian)將(jiang)所有(you)試(shi)劑溫(wen)度回升至(zhi)室(shi)溫(wen)20-25℃。試(shi)劑及標本(ben)沒(mei)有(you)回到(dao)室溫(wen)（20-25℃）會導致(zhi)所(suo)有(you)標準(zhun)的(de)OD值偏(pian)低(di)。

7、 在洗(xi)板(ban)過程(cheng)中(zhong)如(ru)果(guo)出現(xian)板孔幹(gan)燥(zao)的(de)情況(kuang)，則會(hui)伴隨著(zhe)出現(xian)標準(zhun)曲(qu)線不(bu)成線性，重(zhong)復(fu)性不(bu)好(hao)的(de)現(xian)象(xiang)。所(suo)以(yi)洗(xi)板(ban)拍(pai)幹(gan)後應(ying)立即(ji)進(jin)行(xing)下(xia)壹(yi)步(bu)操(cao)作。

8、 混(hun)合(he)要(yao)均勻(yun)，否則(ze)會出現(xian)重(zhong)復(fu)性不(bu)好(hao)的(de)現(xian)象(xiang)。

9、 反(fan)應(ying)終止液為2M硫(liu)酸，避(bi)免(mian)接觸皮(pi)膚(fu)。

10、 不(bu)要(yao)使用過了(le)有(you)效日(ri)期(qi)的(de)試(shi)劑盒，稀釋或攙(chan)雜使用會(hui)引(yin)起(qi)靈敏度、OD值(zhi)的(de)變(bian)化(hua)。不(bu)要(yao)交換(huan)使用不(bu)同(tong)批(pi)號的(de)盒中(zhong)試(shi)劑。

11、 不(bu)用的(de)微孔板(ban)放進(jin)自(zi)封(feng)袋密封(feng)；標(biao)準(zhun)物(wu)質和(he)無(wu)色(se)的(de)發(fa)色劑對光敏(min)感，因(yin)此(ci)要(yao)避免(mian)直接(jie)暴露(lu)在光線下(xia)。

12、 顯色液若(ruo)有(you)任何顏色(se)表(biao)明(ming)變(bian)質，應(ying)當棄(qi)之。0標(biao)準(zhun)的(de)吸光度值(zhi)小(xiao)於0.5個(ge)單位(wei)（A_450nm< 0.5 ）時(shi)，表(biao)示(shi)試(shi)劑可能變(bian)質。

13、 該(gai)試(shi)劑盒最佳(jia)反(fan)應(ying)溫(wen)度為(wei)25℃，溫(wen)度過高(gao)或過低(di)將(jiang)導致(zhi)檢(jian)測吸光度值(zhi)和(he)靈敏度發(fa)生變(bian)化(hua)。

【儲存】

原(yuan)包(bao)裝應(ying)儲存於2～8℃保(bao)鮮(xian)冷(leng)藏(zang)，切(qie)勿(wu)冷(leng)凍。

【有(you)效期(qi)】

有(you)效期(qi)12個(ge)月(yue);生(sheng)產(chan)日(ri)期(qi)、有(you)效期(qi)、生(sheng)產批(pi)號見外包(bao)裝。