多西(xi)環素(su)ELISA檢(jian)測(ce)試劑(ji)盒說(shuo)明(ming)書(shu)

                          多西(xi)環素(su)快(kuai)速(su)檢(jian)測(ce)試劑(ji)盒

使用(yong)說(shuo)明(ming)書

【測(ce)定(ding)原理(li)】

本試(shi)劑(ji)盒采(cai)用(yong)間(jian)接競(jing)爭ELISA方法(fa)，在微(wei)孔(kong)條(tiao)上(shang)預包被(bei)偶(ou)聯(lian)抗原(yuan)，樣(yang)本(ben)中的殘(can)留物多西(xi)環素(su)將(jiang)和微(wei)孔(kong)條(tiao)上(shang)預包被(bei)的(de)偶(ou)聯(lian)抗原(yuan)競爭多西(xi)環素(su)抗體(ti)，加入(ru)酶標(biao)記物後，用(yong)TMB底物顯色(se)，樣(yang)本(ben)吸光值與其所(suo)含殘(can)留物多西(xi)環素(su)的含(han)量成負相關(guan)，與(yu)標(biao)準(zhun)曲線(xian)比(bi)較(jiao)可(ke)得出相應(ying)殘(can)留物多西(xi)環素(su)的含(han)量。

【試劑(ji)盒技(ji)術(shu)指(zhi)標(biao)】   

規(gui)      格：96孔/盒

靈 敏 度： 0.5ppb

檢測(ce)時間(jian)： 45min

樣(yang)本(ben)檢測(ce)下(xia)限：

組織樣(yang)本(ben)（雞、鴨、豬肉/肝、蝦、魚、雞蛋(dan)）：

多西(xi)環素(su) ………………………………………………10ppb

牛(niu)奶(nai)、蜂(feng)蜜樣(yang)本(ben)：

多西(xi)環素(su)……………………………………………… 20ppb

反應(ying)率(lv)：

多西(xi)環素(su) ……………………………………………100%  

 樣(yang)本(ben)回(hui)收率(lv)：

組     織   …………………………………… 85%±20%

牛(niu)奶(nai)、蜂(feng)蜜  ………………………………  80%±20%

【試劑(ji)盒組成】

1、 微(wei)量測(ce)試孔(kong)：1×96孔板(ban)（12條(tiao)×8孔）

2、 標(biao)準(zhun)溶(rong)液X6瓶(ping)：（1ml/瓶(ping)）0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb

3、 高濃度標(biao)準(zhun)品：×1瓶(ping)：（1ml/瓶(ping)）1ppm

4、 酶標(biao)記物 12ml…………………………紅色(se)帽

5、 抗體(ti)工作液   7ml ………………………綠(lv)色帽

6、 底物A液      7ml ………………………棕色帽

7、 底物B液     7ml  ……………………黑色(se)帽

8、 終  止  液     7ml  ……………………黃色(se)帽

9、 20X濃縮洗(xi)滌液40 ml  ………………白(bai)色帽

10、 2X 濃縮復(fu)溶(rong)液   50ml ·………………藍色(se)帽 

【 所用(yong)儀器(qi)、試(shi)劑(ji)】

具(ju)備(bei)的(de)儀(yi)器(qi)：酶標(biao)儀(yi)、均(jun)質(zhi)器(qi)、振蕩(dang)器(qi)、離(li)心機(ji)、刻(ke)度(du)移(yi)液管(guan)、天(tian)平（感(gan)量0.01g）、氮 吹儀(yi)、刻(ke)度(du)移(yi)液管(guan)

微(wei)量移液器(qi)：單道(dao) 20μl～200μl、單道(dao)100μl～1000μl、多道(dao) 30～300 μl

試           劑(ji)： 甲(jia)醇、正己(ji)烷(wan)、Na₂HPO₄·12H₂O、NaOH

NaH₂PO₄·2H₂O、NaCl

【實驗(yan)前溶(rong)液配制(zhi)】

配液1、20mM PBS緩沖(chong)液

       5.16g Na2HPO4*12H2O；0.87gNaH2PO4*2H2O;8.5gNaCl；

       加入(ru)蒸(zheng)餾(liu)水至1000ml；用於樣(yang)品提取(qu)液的(de)配(pei)制。

配液2、樣(yang)品提取(qu)液的(de)配(pei)制

        取1ml甲(jia)醇與9ml的20mM PBS緩沖(chong)液混(hun)勻。

配液3、 將(jiang)2X濃縮復(fu)溶(rong)液用(yong)去(qu)離(li)子(zi)水按1：1稀釋(shi)。(1份濃縮復(fu)溶(rong)掖(ye)+1份去(qu)離(li)子(zi)水，用於樣(yang)本(ben)提取(qu)後(hou)的復溶(rong)與稀(xi)釋)。

配液4、將(jiang)40ml濃縮洗(xi)滌液（20倍濃縮）用(yong)去(qu)離(li)子(zi)水按照 1：19

               稀釋(shi)（1份濃縮洗(xi)滌液+19份去(qu)離(li)子(zi)水），或按 所需(xu)用量

               配制(zhi)洗滌(di)液。

【樣(yang)本(ben)前處理(li)步(bu)驟】

u 樣(yang)本(ben)處理前(qian)須(xu)知(zhi)

（a）實驗(yan)中必須(xu)使用(yong)壹(yi)次性(xing)吸(xi)頭(tou)，吸取不同試

劑(ji)時要(yao)更(geng)換(huan)吸(xi)頭(tou)。

（b）實驗(yan)之前(qian)須(xu)檢查(zha)各(ge)種(zhong)實驗(yan)器(qi)具(ju)是(shi)否幹(gan)凈，

必要時(shi)可對(dui)實驗(yan)器(qi)具(ju)進(jin)行(xing)清(qing)潔(jie)，以避免(mian)汙染幹(gan)擾實

驗(yan)結(jie)果(guo)。

u 樣(yang)本(ben)處理：

（a）組織樣(yang)本(ben)前處理(li)方法(fa)（不用過柱）

1、 稱取(qu)1±0.05g 均(jun)質(zhi)後的(de)樣(yang)本(ben)於離(li)心管(guan)中(zhong)，加入(ru)4ml樣(yang)品提取(qu)

       液，振蕩(dang)5min，室溫4000r/min 以上(shang)，離(li)心10min；

2、 取1ml上清(qing)液收集(ji)於另(ling)壹(yi)試管(guan)中(zhong);加入(ru)1ml 正(zheng)己(ji)烷(wan),振蕩(dang)1min，

    室溫4000r/min 以上(shang)，離(li)心10min；

3、 取50 µl下(xia)層液體(ti)於另(ling)壹(yi)容器(qi)中(zhong)，加入(ru)200μl樣(yang)本(ben)稀釋液混(hun)合

    30s；

4、 取50 μl 用於分(fen)析

    樣(yang)本(ben)稀釋倍數(shu): 20 倍

（b）蜂蜜處理方法(fa)

1、 準(zhun)確(que)稱取(qu)1±0.05g 蜂蜜樣(yang)本(ben)於離(li)心管(guan)中(zhong)，加入(ru)4ml 樣(yang)品提 取

        液，強(qiang)烈混(hun)合振蕩(dang)5min，室溫 4000r/min以上(shang)，離(li)心10min；

2、 取出50μl 上清(qing)液於另(ling)壹(yi)試管(guan)中(zhong)，加入(ru)450μl樣(yang)本(ben)稀釋混(hun)合

    30s；

3、 取50 μl 用於分(fen)析

樣(yang)本(ben)稀釋倍數(shu): 40 倍

（c）牛(niu)奶(nai)樣(yang)品處理(li)方法(fa)

脫(tuo)脂(zhi)牛(niu)奶(nai)

1、取出50μl 脫(tuo)脂(zhi)牛(niu)奶(nai)與(yu)1950μl樣(yang)本(ben)稀釋液，混(hun)30s；

2、取50 μl 用於分(fen)析

脂肪(fang)奶

3、吸取(qu)1ml 牛(niu)奶(nai)樣(yang)本(ben)於離(li)心管(guan)中(zhong)；於15℃環境3000r/min，離(li)心

   10min；（如(ru)果沒(mei)有冷(leng)凍(dong)離(li)心機(ji)請(qing)預先冷(leng)卻(que)後再離(li)心)

4、取出50μl 牛(niu)奶(nai)於與(yu)1950μl樣(yang)本(ben)稀釋液，混(hun)合30s；

5、取50 μl 用於分(fen)析

   樣(yang)本(ben)稀釋倍數(shu): 40 倍

【 酶標(biao)免(mian)疫(yi)分(fen)析程序(xu)】

u 操作步(bu)驟：

1、 將(jiang)所需(xu)試劑(ji)從冷(leng)藏環(huan)境中(zhong)取(qu)出，置室溫（20-25℃）平衡(heng)30min以上(shang)，註(zhu)意(yi)每種(zhong)液體(ti)試劑(ji)使用(yong)前(qian)均(jun)須(xu)搖(yao)勻。

2、 按板(ban)架(jia)及需要取出微(wei)孔(kong)條(tiao)，將(jiang)不用的微(wei)孔(kong)放入(ru)自(zi)封袋，保存(cun)於2-8℃。

3、 編號：將(jiang)樣(yang)本(ben)和標(biao)準(zhun)品對應(ying)微(wei)孔(kong)按序編(bian)號每個(ge)樣(yang)本(ben)和標(biao)準(zhun)品做2孔平行(xing)，並(bing)記錄標(biao)準(zhun)孔和(he)樣(yang)本(ben)孔所在(zai)的(de)位置。

4、 加標(biao)準(zhun)品/樣(yang)本(ben)50µl /孔，然後(hou)加酶標(biao)記物50μl/孔，再加入(ru)抗體(ti)工作液50µl/孔。輕輕(qing)振蕩(dang)混(hun)勻，用蓋板(ban)膜(mo)蓋板(ban)，25℃環境反(fan)應(ying)30min。

5、 取出用洗(xi)滌液按每孔(kong)250μl洗板(ban)4-5次，每(mei)次浸泡15-30秒，拍(pai)幹(gan)（拍幹(gan)後未(wei)被清(qing)除的氣泡可用幹(gan)凈的槍頭(tou)刺破(po)）。

6、 顯色(se)：每孔(kong)加入(ru)底(di)物液A液50µl再加B液50µl，輕輕(qing)振蕩(dang)混(hun)勻，25℃環境避(bi)光顯色15min。

7、 測(ce)定(ding)：每孔(kong)加入(ru)終(zhong)止(zhi)液50µl，輕輕(qing)振蕩(dang)混(hun)勻，設定(ding)酶標(biao)儀(yi)於450nm處（建(jian)議用(yong)雙(shuang)波(bo)長(chang)450/630nm檢測(ce)在5min內讀完數(shu)據(ju)），測(ce)定(ding)吸光度值（OD值）。

【結(jie)果(guo)判(pan)定(ding)】

結(jie)果(guo)判(pan)定(ding)有兩(liang)種(zhong)方法(fa)，粗略(lve)判(pan)定(ding)可用(yong)第1種(zhong)方法(fa)，定(ding)量判定(ding)用第2種(zhong)方法(fa)。註(zhu)意(yi)樣(yang)本(ben)吸光值與其所(suo)含多(duo)西(xi)環素(su)的(de)含(han)量成負相關(guan)。

1、粗略(lve)判(pan)定(ding)：

    用樣(yang)本(ben)的平均(jun)吸光度值與標(biao)準(zhun)值比較即(ji)可得出其濃度範(fan)圍(ng/ml)。假設(she)樣(yang)本(ben)1 的吸(xi)光度值為(wei)0.3，樣(yang)本(ben)2 的吸(xi)光度值為(wei)1.0，標(biao)準(zhun)液吸(xi)光度值分別是(shi)：0ppb 為(wei)2.243； 0.5ppb 為(wei)1.816；1.5ppb 為(wei)1.415；4.5ppb 為(wei)0.74；1 3.5ppb 為(wei)0.313；40.5ppb 為(wei)0.155。則(ze)樣(yang)本(ben)1 的濃度範(fan)圍是(shi)13.5ppb～4.5ppb；樣(yang)本(ben)2的濃度範(fan)圍是(shi)0.15ppb～0.45ppb，乘以(yi)其(qi)對(dui)應(ying)的稀釋倍數(shu)即為(wei)樣(yang)本(ben)中多西(xi)環素(su)實際濃度。           

1、定(ding)量分析：

所獲(huo)得的每個(ge)濃度標(biao)準(zhun)溶(rong)液和(he)樣(yang)本(ben)吸光度值的平均(jun)值（B）除以第壹(yi)個(ge)標(biao)準(zhun)（0標(biao)準(zhun)）的吸(xi)光度值（B₀）再乘以(yi)100%，即百(bai)分(fen)吸光度值。

B—標(biao)準(zhun)溶(rong)液或(huo)樣(yang)本(ben)溶(rong)液的(de)平均(jun)吸光度值

B₀—0ng/ml標(biao)準(zhun)溶(rong)液的(de)平均(jun)吸光度值

以標(biao)準(zhun)品百(bai)分(fen)吸光率(lv)為(wei)縱(zong)坐標(biao)，以(yi)多西(xi)環素(su)標(biao)準(zhun)品濃度（ng/ml）的半對數(shu)為(wei)橫坐標(biao)，繪(hui)制(zhi)標(biao)準(zhun)曲線(xian)圖。將(jiang)樣(yang)本(ben)的百(bai)分(fen)吸光率(lv)代入(ru)標(biao)準(zhun)曲線(xian)中(zhong)，從標(biao)準(zhun)曲線(xian)上(shang)讀出樣(yang)本(ben)所對應(ying)的(de)濃度，乘以(yi)其(qi)對(dui)應(ying)的稀釋倍數(shu)即為(wei)樣(yang)本(ben)中多西(xi)環素(su)實際濃度。

若利(li)用(yong)試劑(ji)盒專(zhuan)業(ye)分(fen)析軟件(jian)進(jin)行計算，更便於大(da)量樣(yang)品的準(zhun)確(que)、快速(su)分(fen)析。

由多個(ge)不同的實驗(yan)結(jie)果(guo)確(que)定(ding)了精(jing)密度，圖2顯示(shi)出多西(xi)環素(su)檢(jian)測(ce)試劑(ji)盒的(de)精(jing)密度情況(kuang)，獲(huo)得的標(biao)準(zhun)吸收值的變(bian)異系(xi)數(shu)（%CV）對(dui)相應(ying)多(duo)西(xi)環素(su)濃度作曲線(xian)，可(ke)以(yi)看(kan)到在全部(bu)範(fan)圍內(nei)變(bian)異系(xi)數(shu)如(ru)此之(zhi)低，可以(yi)得到很(hen)好的(de)再現(xian)性(xing)。

【註(zhu)意(yi)事項】

1、 使用(yong)前(qian)將(jiang)所有試(shi)劑(ji)溫度(du)回(hui)升(sheng)至室溫20-25℃。試劑(ji)及標(biao)本(ben)沒(mei)有回(hui)到(dao)室溫（20-25℃）會導致(zhi)所(suo)有標(biao)準(zhun)的OD值偏低。

2、 在洗(xi)板(ban)過(guo)程(cheng)中(zhong)如(ru)果出現板(ban)孔(kong)幹(gan)燥(zao)的(de)情況(kuang)，則(ze)會伴(ban)隨著出現標(biao)準(zhun)曲線(xian)不成線(xian)性(xing)，重(zhong)復(fu)性不好的(de)現象。所(suo)以(yi)洗(xi)板(ban)拍(pai)幹(gan)後應(ying)立即進行下(xia)壹(yi)步(bu)操作。

3、 混(hun)合要均(jun)勻，否則(ze)會出現重(zhong)復性(xing)不好的(de)現象。

4、 反應(ying)終止(zhi)液為(wei)2M硫酸(suan)，避(bi)免(mian)接觸皮膚。

5、 不要使用(yong)過(guo)了有效(xiao)日(ri)期的試(shi)劑(ji)盒，稀(xi)釋(shi)或(huo)攙雜使用(yong)會引(yin)起(qi)靈(ling)敏(min)度(du)、OD值的變(bian)化。不要交換(huan)使用(yong)不同批號的盒(he)中(zhong)試劑(ji)。

6、 不用的微(wei)孔(kong)板(ban)放進(jin)自(zi)封袋密封；標(biao)準(zhun)物質(zhi)和無(wu)色的發(fa)色劑(ji)對光敏感，因此要(yao)避(bi)免直(zhi)接暴(bao)露(lu)在(zai)光線(xian)下(xia)。

7、 顯色(se)液若(ruo)有任(ren)何顏色表明(ming)變(bian)質(zhi)，應當(dang)棄之。0標(biao)準(zhun)的吸(xi)光度值小於0.5個(ge)單位（A_450nm< 0.5 ）時，表示(shi)試劑(ji)可能(neng)變(bian)質(zhi)。

8、 該試劑(ji)盒最(zui)佳(jia)反(fan)應溫度(du)為(wei)25℃，溫度(du)過(guo)高或過低將(jiang)導致(zhi)檢(jian)測(ce)吸光度值和靈敏(min)度發(fa)生變(bian)化。

【儲存(cun)】

原包(bao)裝應(ying)儲存於2～8℃保鮮(xian)冷(leng)藏，切勿(wu)冷(leng)凍(dong)。

【有效(xiao)期】

有效(xiao)期12個(ge)月;生產日(ri)期、有效(xiao)期、生產批號見外(wai)包(bao)裝(zhuang)。