潑尼(ni)松(song)ELISA檢測(ce)試劑(ji)盒(he)說明書

潑尼(ni)松(song)快(kuai)速檢測(ce)試劑(ji)盒(he)

（豬牛羊(yang)組(zu)織(zhi)專(zhuan)用(yong)）使(shi)用(yong)說(shuo)明書

【測(ce)定(ding)原理(li)】

        本(ben)試劑(ji)盒(he)采用(yong)間(jian)接(jie)競爭(zheng)ELISA方(fang)法，在微孔(kong)條上(shang)預(yu)包(bao)被(bei)偶聯抗(kang)原，樣(yang)本(ben)中的殘(can)留物(wu)潑尼(ni)松(song)將和微(wei)孔(kong)條上(shang)預(yu)包(bao)被(bei)的(de)偶聯抗(kang)原競(jing)爭(zheng)抗(kang)潑尼(ni)松(song)抗(kang)體(ti)，加(jia)入酶標(biao)記(ji)物(wu)後(hou)，用(yong)TMB底物(wu)顯(xian)色(se)，樣本(ben)吸光值與其(qi)所(suo)含殘(can)留物(wu)潑尼(ni)松(song)的(de)含量(liang)成(cheng)負(fu)相關，與標準曲線比(bi)較即(ji)可得(de)出相應(ying)殘留(liu)物(wu)潑尼(ni)松(song)的(de)含量(liang)。

【試劑(ji)盒(he)技術(shu)指標(biao)】   

規(gui)      格(ge)：96孔(kong)/盒(he)

靈(ling) 敏 度(du)： 0.1ppb

檢測(ce)時間(jian)： 45min

樣(yang)本檢測(ce)下限：

組(zu)織(zhi) ………………………………………0.3ppb

交叉(cha)反(fan)應(ying)率：

潑尼(ni)松(song)……………………………………100%

樣(yang)本回收(shou)率：

組(zu)織(zhi) …………………………………85%±10%

【試劑(ji)盒(he)組(zu)成(cheng)】

1、 微(wei)量(liang)測(ce)試孔：1×96孔(kong)板(ban)（12條×8孔(kong)）

2、 標(biao)準溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb

3、 酶標(biao)記(ji)物(wu)       7ml………………………紅(hong)色(se)帽

4、 抗(kang)體(ti)工(gong)作(zuo)液(ye)   7ml ………………………綠(lv)色(se)帽

5、 底物(wu)A液(ye)      7ml ………………………棕色(se)帽

6、 底物(wu)B液(ye)     7ml  …………………… 黑色(se)帽

7、 終(zhong)  止(zhi)  液(ye)     7ml  …………………… 黃(huang)色(se)帽

8、 10X濃(nong)縮洗(xi)滌(di)液(ye)40 ml  ……………… 白(bai)色(se)帽

9、 2X 濃(nong)縮復溶(rong)液(ye)  50ml ·………………  藍色(se)帽

【所(suo)用(yong)儀器(qi)、試劑(ji)】   

具備(bei)的(de)儀器(qi)：微(wei)孔酶標(biao)儀、打印(yin)機、均(jun)質(zhi)器(qi) 、氮氣吹幹裝(zhuang)置、

振(zhen)蕩(dang)器(qi)、離(li)心(xin)機、刻(ke)度(du)移液(ye)管(guan)、天(tian)平（感量(liang)0.01g）

微(wei)量(liang)移液(ye)器(qi)：單(dan)道(dao)20µl-200µl，100µl-1000µl、多(duo)道(dao)250µl

（2）試劑(ji)：乙腈、正己烷(wan)、氯化(hua)鈉(na)

【實(shi)驗前溶液配制(zhi)】

配(pei)液1、2×復(fu)溶液：

                將2×濃(nong)縮復溶(rong)液(ye)用(yong)去(qu)離(li)子(zi)水以1：1稀(xi)釋(shi)（1份(fen)1×濃(nong)縮復溶(rong)液(ye)+1份(fen)去離(li)子(zi)水），用(yong)於樣(yang)本(ben)提取和稀(xi)釋(shi)。

配(pei)液2、將40ml濃(nong)縮洗(xi)滌(di)液(ye)（10倍濃(nong)縮）用(yong)去(qu)離(li)子(zi)水按(an)照 1：9稀(xi)釋(shi)（1份(fen)濃(nong)縮洗(xi)滌(di)液(ye)+9份(fen)去離(li)子(zi)水），或(huo)按(an)所(suo)需用(yong)量(liang)配(pei)制(zhi)洗(xi)滌(di)液(ye)。

【樣(yang)本前處(chu)理步驟】   

樣(yang)本前處(chu)理須知(zhi)

處(chu)理任何(he)樣本(ben)時，都(dou)必須註意(yi)：

（1）本(ben)試劑(ji)盒(he)適(shi)用(yong)於檢測(ce)豬牛羊(yang)組(zu)織(zhi)樣(yang)本(ben)。

（2）實(shi)驗中必須使(shi)用(yong)壹(yi)次性(xing)吸頭，在(zai)吸(xi)取不(bu)同的試劑(ji)時要更換吸頭。

（3）實(shi)驗之(zhi)前須檢查(zha)各種實(shi)驗器(qi)具是否(fou)幹凈，必要時可(ke)對(dui)實(shi)驗器(qi)具進行清(qing)潔(jie)，以避(bi)免(mian)汙(wu)染(ran)幹(gan)擾實(shi)驗結果(guo)。

（A）  組(zu)織(zhi)樣(yang)本處(chu)理方法

1、 用(yong)均(jun)質(zhi)器(qi)均(jun)質(zhi)樣(yang)本(ben)；稱取(qu)3±0.05g樣(yang)本於50ml離(li)心(xin)管中，加(jia)入1g氯(lv)化鈉(na)，再加入6ml乙(yi)腈，用(yong)振(zhen)蕩(dang)器(qi)振(zhen)蕩(dang)5分(fen)鐘；4000轉(zhuan)/分(fen)以上(shang),室(shi)溫離(li)心(xin)5分(fen)鐘；

2、 取(qu)上(shang)清(qing)液2ml至(zhi)幹(gan)凈玻璃(li)試管中，於65℃水浴下氮氣/空(kong)氣吹(chui)幹；

3、 加(jia)入1ml正(zheng)己烷(wan)溶解幹燥的殘留物(wu)，再加1ml配(pei)好的1×復(fu)溶液強(qiang)烈(lie)振(zhen)蕩(dang)混(hun)合30s，室(shi)溫4000r/min以上(shang)離(li)心(xin)3分(fen)鐘。

4、 取(qu)50 µl下層(ceng)清(qing)亮液體(ti)用(yong)於分(fen)析(xi)。

樣(yang)本稀(xi)釋(shi)倍數：1  

【酶標(biao)免(mian)疫分(fen)析(xi)程(cheng)序(xu)】

操作(zuo)步驟：

1、 從(cong)4℃冷(leng)藏(zang)環(huan)境中取出所(suo)需試劑(ji)，置室溫（20-25℃）平(ping)衡(heng)30min以上(shang)，註意(yi)每種液(ye)體(ti)試劑(ji)使(shi)用(yong)前均(jun)須搖(yao)勻。

2、 取(qu)出需要數量(liang)的(de)微(wei)孔及框(kuang)架(jia)，將不用(yong)的(de)微孔放入(ru)自(zi)封袋，保存(cun)於2-8℃。

3、 編(bian)號：將樣本(ben)和(he)標準品對(dui)應(ying)微孔(kong)按(an)序編(bian)號，每個(ge)樣本(ben)和標(biao)準品做(zuo)2孔(kong)平行，並(bing)記錄(lu)標準(zhun)孔和樣本孔所(suo)在的(de)位(wei)置。

4、 加(jia)標準品/樣(yang)本50µl /孔(kong)，然後加酶標(biao)記(ji)物(wu)50μl/孔(kong)，再加入抗(kang)體(ti)工(gong)作(zuo)液(ye)50µl/孔(kong)。輕輕振蕩(dang)混(hun)勻(yun)，用(yong)蓋(gai)板(ban)膜(mo)蓋板(ban)，25℃環(huan)境避(bi)光(guang)反(fan)應(ying)30分(fen)鐘。

5、 取(qu)出將孔內(nei)液體(ti)甩幹，用(yong)洗(xi)液(ye)250µl/孔(kong)洗(xi)板(ban)4-5次(ci)，每次(ci)間隔15-30秒，用(yong)吸(xi)水紙拍幹（拍幹(gan)後未被(bei)清(qing)除的氣(qi)泡(pao)可用(yong)幹(gan)凈的槍頭刺(ci)破）。

6、 顯(xian)色(se)：每孔(kong)加入(ru)底物(wu)A液(ye)50ul，再加底物(wu)B液(ye)50ul，輕輕振蕩(dang)混(hun)勻(yun)，25℃環(huan)境中避(bi)光(guang)顯(xian)色(se)15min。

7、 測(ce)定(ding)：每孔(kong)加入(ru)終止(zhi)液50µl，輕輕振蕩(dang)混(hun)勻(yun)，設定(ding)酶標(biao)儀於450nm處(chu)（建議用(yong)雙(shuang)波(bo)長(chang)450/630nm檢測(ce)，在5min內(nei)讀(du)完數據(ju)），測定(ding)每孔(kong)OD值(zhi)。

【結果(guo)判定(ding)】

結果(guo)判定(ding)有兩(liang)種方(fang)法，粗略判(pan)定(ding)可(ke)用(yong)第1種方(fang)法，定(ding)量(liang)判(pan)定(ding)用(yong)第2種方(fang)法。註意(yi)樣本(ben)吸光值與其(qi)所(suo)含潑尼(ni)松(song)的(de)含量(liang)成(cheng)負(fu)相關。

1、粗略判(pan)定(ding)：

     用(yong)樣(yang)本的平均(jun)吸(xi)光(guang)度(du)值與標準吸(xi)光度(du)值(zhi)比(bi)較即(ji)可得(de)出其(qi)濃(nong)度(du)範圍(wei)(ppb)。假設樣(yang)本1的(de)吸光度(du)值為0.310， 樣(yang)本2的(de)吸光度(du)值為0.820，標(biao)準液吸光(guang)度(du)值分(fen)別(bie)是：0ppb為1.810；0.1ppb為1.450；0.3ppb為1.090；0.9ppb為0.720；2.7ppb為0.369；8.1ppb為0.208。則(ze)樣(yang)本(ben)1的(de)濃(nong)度(du)範圍(wei)是2.7ppb-8.1ppb； 樣(yang)本2的(de)濃(nong)度(du)範圍(wei)是0.3ppb-0.9 ppb。乘(cheng)以其(qi)對(dui)應(ying)的稀(xi)釋(shi)倍數即(ji)為樣(yang)本中潑尼(ni)松(song)實(shi)際含量(liang)。

2、定(ding)量(liang)分(fen)析(xi)

（1）百(bai)分(fen)吸(xi)光率的計(ji)算，標(biao)準品或(huo)樣本的百(bai)分(fen)吸(xi)光率等於標(biao)準(zhun)品或(huo)樣本的百(bai)分(fen)吸(xi)光度(du)值的(de)平均(jun)值(zhi)（雙(shuang)孔(kong)）除以第壹(yi)個標準(zhun)（0標(biao)準）的吸光(guang)度(du)值，再乘(cheng)以100%，即(ji)：

B—標(biao)準溶液或(huo)樣(yang)本(ben)溶液(ye)的平(ping)均(jun)吸(xi)光(guang)度(du)值

B₀—0ng/ml標(biao)準溶液的(de)平(ping)均(jun)吸(xi)光(guang)度(du)值

（2）標(biao)準曲線的繪制與計算

以標準(zhun)品百(bai)分(fen)吸(xi)光率為縱(zong)坐標，以金剛烷(wan)胺濃(nong)度(du)（ng /ml）的(de)半對(dui)數為橫(heng)坐標，繪制標(biao)準(zhun)曲線圖。將樣本(ben)的(de)百(bai)分(fen)吸(xi)光率代入(ru)標準曲(qu)線中，從(cong)標(biao)準曲線上(shang)讀(du)出樣本(ben)所(suo)對(dui)應(ying)的濃(nong)度(du)，乘(cheng)以其(qi)對(dui)應(ying)的稀(xi)釋(shi)倍數即(ji)為樣(yang)本中金剛烷(wan)胺實(shi)際含量(liang)。

若(ruo)利用(yong)試劑(ji)盒(he)專業分(fen)析(xi)軟件進行計(ji)算，更便於大(da)量(liang)樣(yang)本(ben)的準確(que)、快速分(fen)析(xi)。（歡(huan)迎來電索(suo)取）   

3、標(biao)準準曲線：

B/B0 (%)

                 0.1                 0.3                 0.9                2.7                 8.1                   

        潑尼(ni)松(song)(ppb) [µg/kg]

圖1：潑尼(ni)松(song)檢測(ce)試劑(ji)盒(he)的回歸曲(qu)線

4、再現性(xing)：

%CV

       0       0.1      0.3            0.9          2.7           8.1       

潑尼(ni)松(song)(ppb) [µg/kg]

圖2：潑尼(ni)松(song)檢測(ce)試劑(ji)盒(he)的精密(mi)度(du)

由(you)多(duo)個不(bu)同的實(shi)驗結果(guo)確定(ding)了(le)精密(mi)度(du)，圖2顯(xian)示出潑尼(ni)松(song)檢測(ce)試劑(ji)盒(he)的(de)精密(mi)度(du)情況(kuang)，獲得的(de)標準(zhun)吸收值的(de)變(bian)異(yi)系數(shu)（%CV）對(dui)相應(ying)潑尼(ni)松(song)濃(nong)度(du)作(zuo)曲(qu)線，可以看(kan)到在全部範圍內(nei)變(bian)異(yi)系數(shu)如此(ci)之(zhi)低(di)，可(ke)以得到很好的再現性(xing)。

【註意(yi)事(shi)項(xiang)】

1、 使(shi)用(yong)前將所(suo)有試劑(ji)溫度(du)回升至(zhi)室(shi)溫(wen)20-25℃。試劑(ji)及標(biao)本沒有回到室溫（20-25℃）會導(dao)致所(suo)有標(biao)準的(de)OD值(zhi)偏低。

2、 在(zai)洗(xi)板(ban)過程(cheng)中如果(guo)出現板(ban)孔(kong)幹燥的情況(kuang)，則(ze)會伴隨著出現標(biao)準曲(qu)線不成(cheng)線性(xing)，重復(fu)性(xing)不好的(de)現(xian)象(xiang)。所(suo)以洗(xi)板(ban)拍(pai)幹後應(ying)立即(ji)進行下壹步操作(zuo)。

3、 混(hun)合要均(jun)勻(yun)，否(fou)則(ze)會出現重復(fu)性(xing)不好的(de)現(xian)象(xiang)。

4、 反(fan)應(ying)終止(zhi)液為2M硫(liu)酸(suan)，避(bi)免(mian)接(jie)觸皮(pi)膚(fu)。

5、 不(bu)要使(shi)用(yong)過了(le)有效(xiao)日(ri)期的(de)試劑(ji)盒(he)，稀(xi)釋(shi)或(huo)攙雜(za)使(shi)用(yong)會引起靈敏度(du)、OD值的(de)變(bian)化(hua)。不要交換(huan)使(shi)用(yong)不(bu)同批號的盒(he)中試劑(ji)。

6、 不(bu)用(yong)的(de)微孔板(ban)放進自(zi)封袋密(mi)封；標準(zhun)物(wu)質和(he)無色(se)的發色(se)劑(ji)對(dui)光敏感，因(yin)此(ci)要避(bi)免(mian)直接(jie)暴露在(zai)光線下。

7、 顯(xian)色(se)液若(ruo)有任何(he)顏色(se)表明變(bian)質(zhi)，應(ying)當棄(qi)之(zhi)。0標(biao)準(zhun)的吸光度(du)值小(xiao)於0.5個(ge)單位（A_450nm< 0.5 ）時(shi)，表(biao)示試劑(ji)可能(neng)變(bian)質(zhi)。

8、 該(gai)試劑(ji)盒(he)最佳(jia)反(fan)應(ying)溫度(du)為25℃，溫(wen)度(du)過高(gao)或(huo)過低(di)將導(dao)致檢測(ce)吸光(guang)度(du)值和(he)靈敏度(du)發生變(bian)化(hua)。

【儲(chu)存(cun)】原包(bao)裝(zhuang)應(ying)儲(chu)存(cun)於2～8℃保鮮(xian)冷(leng)藏(zang)，切(qie)勿(wu)冷(leng)凍(dong)。

【有效(xiao)期】有效(xiao)期12個(ge)月;生產日(ri)期、有效(xiao)期、批(pi)號見(jian)外(wai)包(bao)裝(zhuang)。