赭曲黴(mei)毒素(su)AELISA檢(jian)測(ce)試(shi)劑(ji)盒(he)說明(ming)書

                    赭曲黴(mei)毒素(su)A快(kuai)速檢(jian)測(ce)試(shi)劑(ji)盒(he)

使(shi)用說明(ming)書

【產(chan)品簡介】

  赭曲黴(mei)毒素(su)A是(shi)黴(mei)菌(jun)毒素(su)，它(ta)具(ju)有(you)很強的(de)致(zhi)癌(ai)性(xing)，主(zhu)要存在於(yu)谷(gu)物、堅(jian)果(guo)、棉籽以及(ji)壹些和(he)人(ren)類(lei)血(xue)液(ye)，動(dong)物飼料相(xiang)關(guan)的產品(pin)中。其中赭曲黴(mei)毒素(su)A的(de)毒性(xing)、致(zhi)癌(ai)性(xing)、汙染頻率均居於(yu)首(shou)wei。薄(bo)層(ceng)色(se)譜(pu)壹直是(shi)檢(jian)測(ce)赭曲黴(mei)毒素(su)A常(chang)用的(de)方(fang)法，但(dan)是(shi)此方法制備(bei)樣品及(ji)分析(xi)樣(yang)品(pin)時費(fei)時又(you)費(fei)力(li)。而使用(yong)赭曲黴(mei)毒素(su)A ELISA試(shi)劑(ji)盒(he)則能(neng)夠快(kuai)速而準確(que)的(de)分(fen)析(xi)樣(yang)品(pin)中赭曲黴(mei)毒素(su)A殘(can)留(liu)。

【測(ce)定原理】

本(ben)試劑(ji)盒(he)采用(yong)間接競(jing)爭ELISA方(fang)法，在微(wei)孔條上(shang)預包被偶(ou)聯(lian)抗(kang)原，樣本(ben)中的殘(can)留(liu)物赭曲黴(mei)毒素(su)A和(he)微(wei)孔條上(shang)預包被的(de)偶(ou)聯(lian)抗(kang)原競(jing)爭赭曲黴(mei)毒素(su)A抗(kang)體(ti)，加(jia)入酶標記(ji)物後，用TMB底物顯(xian)色(se)，樣本(ben)吸(xi)光(guang)值與(yu)其所(suo)含殘留(liu)物赭曲黴(mei)毒素(su)A的(de)含量成負相(xiang)關(guan)，與標準曲線比(bi)較可(ke)得(de)出相(xiang)應(ying)殘留(liu)物赭曲黴(mei)毒素(su)A的(de)含量。

【試(shi)劑(ji)盒(he)技術指(zhi)標】   

規(gui)       格(ge)：96孔(kong)/盒(he)

靈 敏(min) 度(du)：0. 1ppb

檢(jian)測(ce)時間： 75min

樣(yang)本(ben)檢(jian)測(ce)下限：

牛奶……………………………………………1ppb

奶粉(fen)、奶油(you)、奶酪……………………………0.1ppb

飼料、谷物、玉米、花生(sheng)、豆(dou)類……………10ppb

反(fan)應(ying)率(lv)：

赭曲黴(mei)毒素(su)A……………………………………100%

回(hui)收率(lv)：

食    品(pin)…………………………………………85±10%

飼    料(liao)…………………………………………75±10%

【試(shi)劑(ji)盒(he)組成】   

1、 微(wei)量測試(shi)孔(kong)：（1X96孔(kong)板）每(mei)條8孔(kong)，壹板12條(tiao)

1、 標準液(ye)X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb       高(gao)濃度(du)標準品：×1瓶（1ml/瓶） 100ppb

2、 酶標記(ji)物       12ml…………………………紅(hong)色帽

3、 抗(kang)體(ti)工(gong)作液(ye)     7ml…………………………綠(lv)色(se)帽

4、 底物液(ye) A液(ye)    7ml…………………………棕(zong)色(se)帽

5、 底物液(ye) B液(ye)    7ml…………………………黑(hei)色(se)帽

6、 終(zhong) 止(zhi) 液(ye)          7ml…………………………黃(huang)色帽

7、 20X濃(nong)縮洗(xi)滌液(ye)40ml…………………… 白色(se)帽

8、 2X濃(nong)縮復溶液(ye)50 ml…………………藍(lan)色帽

【所(suo)用(yong)儀(yi)器(qi)、試劑(ji)】   

儀(yi)          器(qi)：微(wei)孔板酶標儀(yi)450nm/630nm、旋(xuan)轉(zhuan)蒸發(fa)儀(yi)/

                     氮(dan)氣吹(chui)幹裝(zhuang)置(zhi)、均質器(qi)、振蕩(dang)器(qi)、離心(xin)機、

                     刻(ke)度(du)移(yi)液(ye)管、天(tian)平（感(gan)量0.01g ）

微(wei)量移液(ye)器(qi)：單道 20µl～200µl、100µl～1000µl、多(duo)道 250µl

試(shi)           劑(ji)：甲醇、正己(ji)烷(wan)、濾(lv)紙

【實(shi)驗前(qian)溶(rong)液(ye)配制】

        30ml蒸餾(liu)水(shui)或去(qu)離子水(shui)和(he)70ml純(chun)甲醇混(hun)合(he)制

         備(bei)70％甲醇溶(rong)液(ye)。

配(pei)液(ye)2、將(jiang)1X復溶液(ye)將(jiang)

2X濃(nong)縮復溶液(ye)用(yong)去離子水(shui)按(an)照1：1稀(xi)釋（1 份(fen)濃縮(suo)樣(yang)品液(ye)

+1份(fen)去離子水(shui)）用(yong)於(yu)樣(yang)品(pin)的(de)稀釋(shi)與(yu)復溶。

配(pei)液(ye)3、將(jiang)40ml濃(nong)縮洗(xi)滌液(ye)（20倍(bei)濃縮(suo)）用(yong)去離子水(shui)按(an)照1：19

              稀(xi)釋（1份(fen)濃縮(suo)洗(xi)滌液(ye)+19份(fen)去離子水(shui)），或(huo)按(an)所(suo)需用量

              配(pei)制洗(xi)滌液(ye)。

【樣(yang)本(ben)前(qian)處(chu)理步(bu)驟(zhou)】   

處(chu)理任(ren)何(he)樣(yang)本(ben)時，都(dou)必須(xu)註意：

（a）實(shi)驗中必須(xu)使用(yong)壹次(ci)性(xing)吸(xi)頭(tou)，在吸(xi)取不同的(de)試(shi)劑(ji)時要更換(huan)吸(xi)頭(tou)。

（b）實(shi)驗之(zhi)前(qian)須(xu)檢(jian)查(zha)實(shi)驗(yan)器(qi)具(ju)是(shi)否(fou)幹凈(jing)，必要時可(ke)對(dui)實驗(yan)器(qi)具(ju)進行(xing)清(qing)潔，以避(bi)免汙染幹擾(rao)實驗(yan)結(jie)果(guo)。

（a）生(sheng)鮮牛奶；

     1、直接取50µl牛奶+450µl稀(xi)釋好(hao)的(de)復溶液(ye)混(hun)合(he)30s；

     2、取50µl用(yong)於(yu)檢(jian)測(ce)檢(jian)測(ce)分(fen)析。

          樣(yang)本(ben)稀釋(shi)倍(bei)數(shu):10

（b）奶粉(fen)、奶油(you)、奶酪

1、稱(cheng)取5g樣(yang)品於(yu)50ml離心(xin)管中，加入(ru)10ml甲醇，強力(li)振蕩(dang)5min；室(shi)溫4000r/min以上，離心(xin)10min。

2、取2ml上(shang)清液(ye)，於(yu)50℃水(shui)浴(yu)中氮氣/空(kong)氣吹(chui)幹。

3、用(yong)1ml正己(ji)烷(wan)溶解(jie)殘留(liu)物，加(jia)入(ru)1ml稀(xi)釋後的復溶液(ye)混(hun)合(he)30s；室(shi)溫4000r/min以上，離心(xin)5min，

4、取50ul下層溶(rong)液(ye)進行(xing)檢(jian)測(ce)分(fen)析。

     樣(yang)本(ben)稀釋(shi)倍(bei)數(shu):1

（C）飼料、谷物、玉米、花生(sheng)、豆(dou)類

1、稱(cheng)取2g粉(fen)碎(sui)的(de)樣(yang)品(pin)於(yu)50ml離心(xin)管中，加入(ru)10ml 的(de)提取溶(rong)液(ye)混(hun)合(he)；強力(li)振蕩(dang)5分(fen)鐘。

2、用(yong)Whatman No.濾(lv)紙過(guo)濾(lv)；收集(ji)過(guo)濾液(ye)。

3、取出上(shang)清(qing)液(ye)50ul與(yu)950ul 稀(xi)釋好(hao)的(de)復溶液(ye)充(chong)分混(hun)合(he)30s

      取50ul進行(xing)檢(jian)測(ce)分(fen)析。

          樣(yang)本(ben)稀釋(shi)倍(bei)數(shu):100

【酶標免(mian)疫分(fen)析(xi)程(cheng)序】

操(cao)作步(bu)驟(zhou)：

1、 將(jiang)所(suo)需試劑(ji)從冷(leng)藏環境(jing)中取出，置(zhi)室(shi)溫（20-25℃）平(ping)衡30min以上，註意每種(zhong)液(ye)體(ti)試(shi)劑(ji)使用(yong)前(qian)均須(xu)搖(yao)勻(yun)。

2、 按(an)板架及(ji)需要取出微(wei)孔條，將(jiang)不用的(de)微(wei)孔放入(ru)自封袋(dai)，保存(cun)於(yu)2-8℃。

3、 編(bian)號：將樣(yang)本(ben)和(he)標準品對應(ying)微(wei)孔按序編號每個(ge)樣本(ben)和(he)標準品做2孔(kong)平行(xing)，並記(ji)錄標準孔和(he)樣(yang)本(ben)孔所(suo)在的(de)位置(zhi)。

4、 加(jia)標準品/樣(yang)本(ben)50µl/孔(kong)到(dao)各自(zi)的(de)微(wei)孔中，然後加抗(kang)體(ti)50µl/孔(kong)，用(yong)蓋板膜(mo)封板，輕(qing)輕(qing)震(zhen)蕩(dang)混(hun)勻。25℃環(huan)境中反(fan)應(ying)30min。

5、 取出將(jiang)孔(kong)內(nei)液(ye)體(ti)甩(shuai)幹，用(yong)洗(xi)液(ye)250µl/孔(kong)洗(xi)板4-5次(ci)，每次(ci)間隔15-30秒(miao)，用吸(xi)水(shui)紙(zhi)拍幹（拍(pai)幹後未(wei)被清(qing)除的(de)氣泡可(ke)用(yong)幹凈(jing)的(de)槍(qiang)頭(tou)刺破(po)）。

6、 每(mei)孔加(jia)入(ru)酶標記(ji)物100µl，蓋(gai)板膜(mo)蓋(gai)板後置(zhi)25℃環(huan)境中反(fan)應(ying)30min。將(jiang)孔內(nei)液(ye)體(ti)甩(shuai)幹，用(yong)洗(xi)滌液(ye)充分(fen)洗(xi)，4-5遍(bian)（同上(shang)），用(yong)吸(xi)水(shui)紙(zhi)拍幹（拍(pai)幹後未(wei)被清(qing)除的(de)氣泡可(ke)用(yong)幹凈(jing)的(de)槍(qiang)頭(tou)刺破(po)）。

7、  顯(xian)色：每(mei)孔(kong)加入(ru)A液(ye)50µl，再加B液(ye)50µl，輕(qing)輕振蕩(dang)混(hun)勻，25℃環(huan)境中避(bi)光顯(xian)色(se)15min。

8、 測(ce)定：每(mei)孔(kong)加入(ru)終(zhong)止(zhi)液(ye)50µl，輕(qing)輕振蕩(dang)，設(she)定(ding)酶標儀(yi)於(yu)450nm處(chu)（建議(yi)用雙(shuang)波(bo)長(chang)450/630nm檢(jian)測(ce),在5min內(nei)讀完(wan)數據）測(ce)定(ding)吸(xi)光(guang)度(du)值（OD值）。

【結(jie)果(guo)判定(ding)】

結(jie)果(guo)判定(ding)有兩(liang)種(zhong)方法(fa)，粗略(lve)判定(ding)可(ke)用(yong)第1種(zhong)方法(fa)，定量判定(ding)用第(di)2種(zhong)方法(fa)。註意樣本(ben)吸(xi)光(guang)值與(yu)赭曲黴(mei)毒素(su)A的(de)含量成負相(xiang)關(guan)。

1、粗略(lve)判定(ding)：

用(yong)樣品(pin)的(de)平均吸(xi)光(guang)度(du)值與(yu)標準值比(bi)較即可(ke)得(de)出樣(yang)本(ben)所(suo)含沙(sha)丁胺(an)醇濃(nong)度(du)範圍（ng/ml）。假(jia)設(she)樣品(pin)1的(de)吸(xi)光(guang)度(du)值為(wei)0.313，樣(yang)品2的(de)吸(xi)光(guang)度(du)值為(wei)1.032，標準液(ye)吸(xi)光(guang)度(du)值分(fen)別(bie)是(shi)：0ppb為(wei)1.892；0.1ppb為(wei)1.501；0.3ppb為(wei)1.175；0. 9ppb為(wei)0.751；2.7ppb為(wei)0.421； 8.1ppb為(wei)0.198。則(ze)樣品(pin)1的(de)濃度(du)範(fan)圍是(shi)2.7ppb-8.1ppb；樣(yang)品2的(de)濃度(du)範(fan)圍是(shi)0.3ppb-0.9ppb。乘(cheng)以其對(dui)應(ying)的稀釋倍數(shu)即(ji)為(wei)樣本(ben)中赭曲黴(mei)毒素(su)A的(de)實際(ji)含量。

2、定(ding)量判定(ding)：

所(suo)獲(huo)得的每個(ge)濃(nong)度(du)標準溶液(ye)和(he)樣(yang)本(ben)吸(xi)光(guang)度(du)值的(de)平(ping)均值（B）除以第壹(yi)個標準（0標準）的吸(xi)光(guang)度(du)值（B₀）再乘以100%，即(ji)百分(fen)吸(xi)光(guang)度(du)值。

B—標準溶液(ye)或樣(yang)本(ben)溶液(ye)的平(ping)均吸(xi)光(guang)度(du)值

B₀—0ng/ml標準溶液(ye)的平(ping)均吸(xi)光(guang)度(du)值

以標準品百分(fen)吸(xi)光(guang)率(lv)為(wei)縱(zong)坐標，以赭曲黴(mei)毒素(su)A標準品濃度(du)（ng/ml）的(de)半(ban)對數(shu)為(wei)橫坐標，繪(hui)制標準曲線圖。將樣(yang)本(ben)的百分(fen)吸(xi)光(guang)率(lv)代入(ru)標準曲線中，從標準曲線上讀出樣(yang)本(ben)所(suo)對(dui)應的濃度(du)，乘(cheng)以其對(dui)應(ying)的稀釋倍數(shu)即(ji)為(wei)樣本(ben)中赭曲黴(mei)毒素(su)A實(shi)際(ji)濃(nong)度(du)。

若利用(yong)試劑(ji)盒(he)專業(ye)分析軟(ruan)件進行(xing)計(ji)算(suan)，更(geng)便(bian)於(yu)大(da)量樣品(pin)的(de)準確(que)、快(kuai)速分析(xi)。

3、標準準曲線：

3、標準準曲線：

B/B0 (%)

0.1       0.3        0.9        2.7        8.1

赭曲黴(mei)毒素(su)A (ppb) [µg/kg]

圖1：赭曲黴(mei)毒素(su)A檢(jian)測(ce)試(shi)劑(ji)盒(he)的回(hui)歸(gui)曲(qu)線

4、再現性(xing)：

%CV 

  0      0.1     0.3      0.9    2.7    8.1

赭曲黴(mei)毒素(su)A (ppb) [µg/kg]

圖2：赭曲黴(mei)毒素(su)A檢(jian)測(ce)試(shi)劑(ji)盒(he)的(de)精密(mi)度(du)

由(you)多個(ge)不同的(de)實(shi)驗(yan)結(jie)果(guo)確(que)定(ding)了(le)精(jing)密(mi)度(du)，圖2顯(xian)示出赭曲黴(mei)毒素(su)A檢(jian)測(ce)試(shi)劑(ji)盒(he)的(de)精密(mi)度(du)情(qing)況(kuang)，獲(huo)得(de)的標準吸(xi)收(shou)值的(de)變(bian)異系(xi)數（%CV）對(dui)相(xiang)應(ying)赭曲黴(mei)毒素(su)A濃(nong)度作(zuo)曲(qu)線，可(ke)以看(kan)到(dao)在全部(bu)範(fan)圍內(nei)變異系(xi)數如此之(zhi)低(di)，可(ke)以得到(dao)很好(hao)的再現性(xing)。

【註意事(shi)項】

1、 使(shi)用前(qian)將(jiang)所(suo)有(you)試劑(ji)溫度(du)回(hui)升(sheng)至室(shi)溫20-25℃。試(shi)劑(ji)及(ji)標本(ben)沒有(you)回(hui)到(dao)室(shi)溫（20-25℃）會導致(zhi)所(suo)有(you)標準的OD值偏低。

2、 在洗(xi)板過(guo)程(cheng)中如果(guo)出現(xian)板孔(kong)幹燥的情(qing)況(kuang)，則(ze)會伴(ban)隨著出現(xian)標準曲線不成線性(xing)，重(zhong)復性(xing)不好的(de)現(xian)象(xiang)。所(suo)以洗(xi)板拍(pai)幹後應立(li)即進行(xing)下壹步(bu)操(cao)作。

3、 混(hun)合(he)要均勻，否(fou)則會出現(xian)重(zhong)復性(xing)不好的(de)現(xian)象(xiang)。

4、 反(fan)應(ying)終(zhong)止(zhi)液(ye)為(wei)2M硫(liu)酸，避(bi)免接觸(chu)皮膚(fu)。

5、 不要使用(yong)過了(le)有(you)效(xiao)日期(qi)的試(shi)劑(ji)盒(he)，稀釋(shi)或攙雜使用會引起(qi)靈敏度、OD值的(de)變(bian)化。不要交換(huan)使用(yong)不同批(pi)號的盒(he)中試劑(ji)。

6、 不用的(de)微(wei)孔板放(fang)進自封袋(dai)密(mi)封；標準物質(zhi)和(he)無(wu)色(se)的(de)發(fa)色劑(ji)對光(guang)敏(min)感(gan)，因(yin)此(ci)要避(bi)免直接暴(bao)露(lu)在光(guang)線下。

7、 顯(xian)色液(ye)若有(you)任(ren)何(he)顏色表明變(bian)質(zhi)，應(ying)當棄(qi)之(zhi)。0標準的吸(xi)光(guang)度(du)值小(xiao)於(yu)0.5個(ge)單位（A_450nm< 0.5 ）時，表(biao)示試(shi)劑(ji)可(ke)能(neng)變質(zhi)。

8、 該試劑(ji)盒(he)最(zui)佳(jia)反(fan)應(ying)溫(wen)度(du)為(wei)25℃，溫(wen)度過(guo)高(gao)或過(guo)低將(jiang)導致(zhi)檢(jian)測(ce)吸(xi)光(guang)度(du)值和(he)靈敏度發(fa)生(sheng)變化(hua)。

【儲(chu)存】

原包裝應(ying)儲(chu)存(cun)於(yu)2～8℃保(bao)鮮冷藏，切(qie)勿(wu)冷(leng)凍(dong)。

【有(you)效(xiao)期(qi)】有(you)效(xiao)期(qi)12個(ge)月(yue);生(sheng)產日(ri)期(qi)、有效(xiao)期(qi)、批號見外包(bao)裝(zhuang)。