馬(ma)傳(chuan)染性貧血(xue)病(bing)病(bing)毒(du)PCR檢測(ce)試劑盒(he)說(shuo)明(ming)書(shu)

【產(chan)品名(ming)稱(cheng)】

通(tong)用(yong)名(ming)稱(cheng)：馬傳(chuan)染(ran)性貧血(xue)病(bing)病(bing)毒(du)PCR檢測(ce)試劑盒(he)（實(shi)時(shi)熒光PCR法）

英(ying)文名(ming)稱(cheng)：Equine Infectious Anemia Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包(bao)裝規(gui)格(ge)】25T/盒(he) ＆ 50T/盒(he)

【檢(jian)驗(yan)原(yuan)理(li)】

本試劑盒(he)針對(dui)手(shou)EIAV高(gao)度(du)保守區(qu)域設計(ji)特(te)異性引(yin)物(wu)和探針，在反(fan)應(ying)體(ti)系中含(han)EIAV基因組(zu)模(mo)板的(de)情(qing)況下，PCR反(fan)應(ying)得(de)以(yi)進(jin)行並釋放(fang)熒光信(xin)號(hao)。利(li)用(yong)熒光定(ding)量PCR儀對(dui)PCR過(guo)程(cheng)中(zhong)相(xiang)應通(tong)道信(xin)號(hao)進(jin)行(xing)實(shi)時(shi)監測(ce)和輸(shu)出，實(shi)現(xian)檢(jian)測(ce)結果(guo)的(de)定性分析(xi)。

【主要(yao)組成(cheng)成份(fen)】

註(zhu)：陰性(xing)對(dui)照為滅(mie)菌純水(shui)，陽(yang)性(xing)對(dui)照為含(han)EIAV靶基因的(de)質粒(li)。

【儲(chu)存條件(jian)及有(you)效(xiao)期】避(bi)光(guang)-20℃以(yi)下保存，避(bi)免(mian)反(fan)復(fu)凍(dong)融(rong)，有(you)效(xiao)期12個(ge)月(yue)。

【適(shi)用(yong)儀器(qi)】ABI 系列(lie)、Bio-Rad系列(lie)、Agilent Stratagene MX系列(lie)、Roche LightCycler 480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列(lie)、杭(hang)州博日(ri)系列(lie)等(deng)多(duo)通(tong)道實(shi)時(shi)熒光定(ding)量PCR儀。

【樣(yang)本要(yao)求】

1.樣(yang)本為(wei)血(xue)液(ye)和(he)臟(zang)器(qi)（肝(gan)、脾、骨(gu)髓(sui)、淋(lin)巴(ba)結等(deng)）。

2.樣(yang)本采(cai)集後應(ying)立(li)即(ji)檢測(ce)，若(ruo)不能(neng)立(li)即(ji)檢測(ce)，應置於-80℃冷凍(dong)保存，避(bi)免(mian)反(fan)復(fu)凍(dong)融(rong)，用(yong)幹冰或(huo)液(ye)氮(dan)運輸(shu)。

【檢(jian)驗(yan)方(fang)法】

1. 試劑準備（試劑準備區(qu)）

（1）從冰箱中(zhong)取出試劑盒(he), 從試劑盒(he)中(zhong)取出實(shi)驗(yan)所需(xu)試劑，充分融(rong)化(hua)混勻(yun)並瞬時離心以(yi)去除管(guan)壁附(fu)著液(ye)體(ti)。

（2）核(he)算當(dang)次(ci)實(shi)驗(yan)所需(xu)要(yao)的(de)反(fan)應(ying)數(shu)（n），並根(gen)據(ju)如下表所示反(fan)應(ying)體(ti)系計算當(dang)次(ci)實(shi)驗(yan)所需(xu)要(yao)的(de)各種(zhong)試劑量。

n =陰性(xing)對(dui)照數(shu)（1T）+陽(yang)性(xing)對(dui)照數(shu)（1T）+誤差預(yu)留量（1T）+樣(yang)本數(shu)

（3）在無菌離心(xin)管中加(jia)入上述試劑，充分混勻(yun)後瞬時離心。按(an)照20 μL/管(guan)分(fen)裝量將(jiang)試劑分(fen)裝至PCR反(fan)應(ying)管(guan)。

2.樣(yang)本準備（樣本處(chu)理(li)區(qu)）

用(yong)DNA/RNA提(ti)取試劑盒(he)提(ti)取核酸(suan)即(ji)可，具(ju)體(ti)操(cao)作(zuo)按(an)照其(qi)試劑盒(he)說(shuo)明(ming)書(shu)操(cao)作(zuo)。

3.加(jia)樣(yang)

  在上述制(zhi)備(bei)好的(de)PCR反(fan)應(ying)管(guan)中(zhong)分(fen)別(bie)加(jia)入處(chu)理(li)好的(de)待(dai)測(ce)標本RNA各(ge)5μl、終(zhong)體(ti)積(ji)25μl/管(guan)，蓋好PCR反(fan)應(ying)蓋混勻(yun)後瞬時低速(su)離心(xin)，轉移到(dao)PCR儀器(qi)上。

   根(gen)據(ju)需(xu)要(yao)，在上述準備好的(de)PCR反(fan)應(ying)管(guan)中(zhong)分(fen)別(bie)加(jia)入陰性(xing)對(dui)照品以(yi)及陽(yang)性對(dui)照品各(ge)5μl，終(zhong)體(ti)積(ji)為25μl/管(guan)，蓋好PCR反(fan)應(ying)蓋混勻(yun)後瞬時低速(su)離心(xin)，轉移到(dao)PCR儀器(qi)上。

4. PCR（PCR擴(kuo)增(zeng)區(qu)）

（1）取樣本處(chu)理(li)區(qu)準備好的(de)PCR反(fan)應(ying)管(guan)，放(fang)置在實(shi)時(shi)熒光定(ding)量PCR儀樣(yang)品(pin)槽相(xiang)應位置，並記錄放(fang)置順(shun)序(xu)。

（2）按(an)下表設置儀器(qi)核(he)酸(suan)擴(kuo)增(zeng)相(xiang)關參數(shu)進(jin)行PCR擴(kuo)增(zeng)。

註(zhu)：ABI系列(lie)熒光PCR儀在設(she)置時不(bu)選ROX校(xiao)正(zheng)，設置淬滅(mie)基團(tuan)選擇(ze)None。

【參考(kao)值(zhi)（參考(kao)範(fan)圍）】

1.試劑盒(he)有(you)效(xiao)性(xing)判(pan)定：

（1）陽(yang)性(xing)對(dui)照：有(you)典(dian)型(xing)S型(xing)擴(kuo)增(zeng)曲(qu)線(xian)或(huo)Ct值(zhi)≤35。

（2）陰性(xing)對(dui)照：Ct值(zhi)＞38或(huo)無Ct值(zhi)，線形為直(zhi)線或(huo)輕(qing)微(wei)斜線(xian)，無指數(shu)增(zeng)長期。

2.標(biao)本結果(guo)判(pan)定：

（1）陽(yang)性(xing)：標(biao)本檢(jian)測(ce)結果(guo)Ct值(zhi)≤35或(huo)有(you)明(ming)顯指數(shu)增(zeng)長期。

（2）可(ke)疑：標(biao)本檢(jian)測(ce)結果(guo)Ct值(zhi)在35～38範(fan)圍內。此時應(ying)對(dui)標本進(jin)行重復檢(jian)測(ce)，如重復實(shi)驗(yan)結果(guo)Ct值(zhi)仍(reng)在35～38範(fan)圍內，有(you)明(ming)顯指數(shu)增(zeng)長期，則(ze)判(pan)定為陽(yang)性(xing)，否(fou)則(ze)為(wei)陰性(xing)。

（3）陰性(xing)：標(biao)本檢(jian)測(ce)結果(guo)Ct值(zhi)＞38或(huo)無Ct值(zhi)。

【檢(jian)驗(yan)結果(guo)的(de)解(jie)釋(shi)】

【檢(jian)驗(yan)方(fang)法的(de)局(ju)限性(xing)】

1. 當(dang)檢測(ce)樣本中(zhong)被檢(jian)核酸(suan)濃度低於本試劑盒(he)的(de)最d檢出限shi可(ke)能(neng)會(hui)發生(sheng)假(jia)陰性(xing)的(de)結果(guo)。

2. 被檢(jian)樣本在采(cai)集、運輸(shu)、儲(chu)存以及處(chu)理(li)過程中操(cao)作(zuo)方(fang)式(shi)不當(dang)容(rong)易(yi)造成(cheng)RNA降(jiang)解(jie)而(er)產(chan)生(sheng)假(jia)陰性(xing)結果(guo)。

3. 樣(yang)本在采(cai)集、運輸(shu)、儲(chu)存以及處(chu)理(li)過程中發生(sheng)交(jiao)叉(cha)汙染(ran)，則(ze)容(rong)易(yi)得到(dao)假(jia)陽(yang)性(xing)結果(guo)。

【產(chan)品性(xing)能(neng)指標】 產(chan)品的(de)最d檢出限為(wei)10³ Copies/mL，產(chan)品CV值(zhi)≤3%。

【註(zhu)意(yi)事(shi)項(xiang)】

1. 使(shi)用(yong)本試劑盒(he)的(de)實(shi)驗(yan)室(shi)，應嚴(yan)格按(an)照國家有(you)關部分頒布的(de)有(you)關基因擴(kuo)增(zeng)檢(jian)驗(yan)實(shi)驗(yan)室(shi)管理(li)規(gui)範(fan)進行管理(li)；

2. 為(wei)避(bi)免(mian)RNA降(jiang)解(jie)，樣(yang)本處(chu)理(li)過程應在0-4℃條(tiao)件(jian)下操(cao)作(zuo)，且(qie)完成實(shi)驗(yan)後立(li)即(ji)上機檢(jian)測(ce)；樣本處(chu)理(li)過程中使(shi)用(yong)的(de)器具(ju)耗材應經過(guo)無核(he)酶(mei)處(chu)理(li)；

3. 各(ge)區(qu)域物品(pin)均(jun)為(wei)專(zhuan)用(yong)，不得(de)交(jiao)叉(cha)使(shi)用(yong)，以免(mian)汙染(ran)；檢測(ce)結束後，應(ying)立(li)即(ji)對(dui)工作(zuo)臺清(qing)潔；

4. 吸(xi)取反(fan)應(ying)液(ye)時(shi)，應(ying)盡(jin)量避(bi)免(mian)產(chan)生(sheng)氣泡；上 PCR 儀前，應註意檢(jian)查(zha)各(ge)反(fan)應(ying)管(guan)是(shi)否(fou)蓋緊，以(yi)免液(ye)體(ti)蒸發造(zao)成結果(guo)不準確；

5. 試劑盒(he)所有(you)試劑在使(shi)用(yong)前應該在常(chang)溫下充分融(rong)化(hua)混勻(yun)，並應瞬時離心；

6. 試劑盒(he)內(nei)所配陰性(xing)和(he)陽性(xing)對(dui)照在第壹次(ci)使(shi)用(yong)前應全部轉移至標本準備區(qu)，並單獨(du)存放(fang)；

7. 為(wei)防(fang)止(zhi)熒光幹(gan)擾(rao)，應避(bi)免(mian)裸(luo)手(shou)直(zhi)接接(jie)觸PCR反(fan)應(ying)管(guan)，並應避(bi)免(mian)在PCR反(fan)應(ying)管(guan)上進行(xing)任(ren)何標記；

8. 檢(jian)測(ce)過程(cheng)中使(shi)用(yong)過的(de)吸(xi)頭(tou)，應直(zhi)接打(da)到盛(sheng)有(you) 10%次(ci)氯(lv)酸(suan)的(de)廢物缸內，檢(jian)測(ce)結束的(de)PCR 反(fan)應(ying)管(guan)，切(qie)忌(ji)開蓋，並與(yu)其(qi)他(ta)廢棄(qi)物(wu)品(pin)壹同(tong)滅(mie)菌後丟(diu)棄(qi)；工作(zuo)臺及各(ge)種(zhong)實(shi)驗(yan)用(yong)品應(ying)定期用(yong) 10%次(ci)氯(lv)酸(suan)、75%酒精(jing)或(huo)紫(zi)外(wai)燈(deng)進(jin)行(xing)消(xiao)毒(du)；

9. 儀器(qi)擴(kuo)增(zeng)相(xiang)關參數(shu)應(ying)按(an)照本說(shuo)明(ming)書(shu)相(xiang)關要(yao)求進(jin)行設置；不同(tong)批(pi)號(hao)試劑不(bu)能(neng)混用(yong)；並在有(you)效(xiao)期內(nei)使(shi)用(yong)。