呋喃唑酮(tong)代(dai)謝(xie)物(wu)快(kuai)速(su)檢測試(shi)劑(ji)盒說(shuo)明(ming)書

                   呋喃唑酮(tong)代(dai)謝(xie)物(wu)快(kuai)速(su)檢測試(shi)劑(ji)盒使(shi)用(yong)說明(ming)書

【產品簡介】

硝(xiao)基呋喃類(lei)藥(yao)物(wu)因(yin)有非常好的(de)抗菌作用(yong)和藥(yao)動(dong)力學的(de)特性(xing)，曾經(jing)被廣(guang)泛應(ying)用(yong)，作為(wei)禽類(lei)、水產和豬(zhu)促生(sheng)長(chang)的(de)添加(jia)劑(ji)。呋喃唑酮(tong)在(zai)1995年(nian)被禁用(yong)。由於硝(xiao)基呋喃類(lei)藥(yao)物(wu)在(zai)體(ti)內(nei)很(hen)快(kuai)就能(neng)被代(dai)謝(xie)，而(er)在組(zu)織(zhi)中(zhong)結合的(de)代謝產物(wu)則(ze)能(neng)存留較長(chang)的(de)壹段(duan)時(shi)間，所(suo)以(yi)管(guan)理部(bu)門就以(yi)檢測代(dai)謝(xie)產物為(wei)手(shou)段(duan)達(da)到(dao)檢測硝(xiao)基呋喃類(lei)殘(can)留(liu)的(de)目的(de)。

呋喃唑酮(tong)代(dai)謝(xie)物(wu)快(kuai)速(su)檢測試(shi)劑(ji)盒具有方便(bian)、快(kuai)速(su)、靈敏(min)等(deng)特點，適用(yong)於動(dong)物組織（水(shui)產(chan)、雞、豬(zhu)、牛(niu)）、牛(niu)奶(nai)等(deng)大批量樣品中(zhong)的(de)呋喃唑酮(tong)代(dai)謝(xie)物(wu)快(kuai)速(su)檢測。

【測(ce)定原理】

本(ben)試(shi)劑(ji)盒采(cai)用(yong)間接競(jing)爭(zheng)ELISA方(fang)法檢測水(shui)產(chan)等(deng)組(zu)織(zhi)樣本中(zhong)的(de)AOZ，在微(wei)孔(kong)條(tiao)上預(yu)包被上(shang)偶聯抗(kang)原，利(li)用(yong)抗原與(yu)抗體(ti)的(de)特異性(xing)免疫化學反(fan)應(ying)的(de)原理來(lai)進(jin)行(xing)的(de)，樣本中(zhong)的(de)AOZ和微(wei)孔(kong)條(tiao)上預(yu)包被偶聯抗(kang)原競(jing)爭(zheng)抗(kang)呋喃唑酮(tong)代(dai)謝(xie)物(wu)的(de)衍生物抗(kang)體(ti)，加(jia)入(ru)酶標記(ji)物(wu)後(hou)，用(yong)TMB底物顯色，樣品中(zhong)的(de)AOZ含量與(yu)樣品的(de)吸光(guang)度(du)值(zhi)呈(cheng)反(fan)比(bi)，與(yu)標準(zhun)曲(qu)線(xian)比(bi)較即(ji)可(ke)得出呋喃唑酮(tong)代(dai)謝(xie)物(wu)含量。

【試(shi)劑(ji)盒技(ji)術(shu)指標】   

規       格：96孔/盒

靈 敏 度(du)： 0.02ppb

檢測時(shi)間： 45min

樣本檢測下(xia)限(xian)：

水產(chan)品、動(dong)物組織(zhi)……………………… 0.12ppb

蜂蜜(mi)、牛(niu)奶(nai)……………………………… 0.12ppb

參(can)考(kao)標準(zhun)GB/T 21311-2007 檢測下(xia)限(xian)為(wei)0.5ppb

交叉反應率：

呋喃唑酮(tong)代(dai)謝(xie)物  …………………………  100%

呋喃它(ta)酮(tong)代謝物(wu)  …………………………﹤0.1%

呋喃妥(tuo)因(yin)代謝(xie)物  …………………………﹤0.1%

呋喃西(xi)林代謝(xie)物(wu)  …………………………﹤0.1%

回收率(lv)：

組織…………………………………………90%±15%

蜂蜜(mi)…………………………………………85%±15%

【試(shi)劑(ji)盒組(zu)成(cheng)】  

1、 微(wei)量測(ce)試孔(kong)：1×96孔(kong)板（12條(tiao)×8孔）

2、 標準(zhun)液(ye)X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.02ppb、0.06ppb、0.18ppb、0.54ppb、1.62ppb

3、 高(gao)濃度(du)標準(zhun)品(pin)：×1瓶：（1ml/瓶） 100ppb

4、 酶(mei)標記(ji)物(wu)    7ml………………………紅色帽

5、 抗體(ti)工作液 7ml………………………綠(lv)色帽

6、 底物(wu)A液   7 ml………………………棕(zong)色帽

7、 底物(wu)B液   7 ml………………………黑色帽

8、 終(zhong)止液(ye)       7 ml………………………黃色帽

9、 20X濃縮(suo)洗(xi)滌液40 ml………………白(bai)色帽

10、 2X濃縮(suo)復溶(rong)液(ye)  50 ml……………… 藍(lan)色帽

11、 衍生化試劑(ji)        10ml ………………  黑色帽

【所(suo)用(yong)儀器(qi)、試(shi)劑(ji)】   

具備的(de)儀器(qi)：微(wei)孔(kong)酶(mei)標儀(yi)、打(da)印機、均(jun)質(zhi)器(qi) 、氮氣(qi)吹幹(gan)裝置(zhi)、振(zhen)蕩(dang)器(qi)、離(li)心機、刻度(du)移液(ye)管(guan)、天平（感(gan)量0.01g）

微(wei)量移(yi)液器(qi)：單(dan)道20µl-200µl，100µl-1000µl、 多(duo)道(dao)250µl

試          劑(ji)：氫(qing)氧化鈉、乙酸(suan)乙酯(zhi)、正(zheng)己烷、磷酸氫(qing)二(er)鉀、濃HCl

【實(shi)驗(yan)前溶(rong)液(ye)配制(zhi)】

配(pei)液1、將2×濃縮(suo)復溶(rong)液(ye)用(yong)去離(li)子(zi)水(shui)按(an)照(zhao)1：1稀釋(shi)（1 份(fen)濃縮(suo)復溶(rong)液(ye)+1份(fen)去離(li)子(zi)水(shui)）用(yong)於樣本的(de)復溶(rong)。

配(pei)液(ye)2、將40ml濃縮(suo)洗(xi)滌液（20倍(bei)濃縮(suo)）用(yong)去離(li)子(zi)水(shui)按(an)照(zhao) 1：19稀釋(shi)（1份(fen)濃縮(suo)洗(xi)滌液+19份(fen)去離(li)子(zi)水(shui)），或按(an)所(suo)需用(yong)量配(pei)制洗(xi)滌液。

配(pei)液(ye)3、 0.1MK₂HPO₄  稱(cheng)11.4g K₂HPO₄·3H₂O

加(jia)去離(li)子(zi)水(shui)溶(rong)解(jie)定容(rong)至(zhi)500ml。

配液(ye)4、1M HCl溶(rong)液(ye)

取(qu)8.6ml濃HCl加(jia)去離(li)子(zi)水(shui)定溶(rong)至(zhi)100ml。

配液(ye)5、1M NaOH溶(rong)液(ye)

               取(qu)4g NaOH加(jia)去離(li)子(zi)水(shui)定容(rong)至(zhi)100ml。

【樣本前處理方法(fa)】   

樣本處(chu)理前須知(zhi)

（1）本(ben)試(shi)劑(ji)盒所(suo)檢測的(de)組織樣本包(bao)括(kuo)：動物(wu)組(zu)織(zhi)、禽類(lei)和水(shui)產(chan)組織(zhi)。eg:雞、鴨(ya)、豬(zhu)、牛(niu)、羊、兔、魚(yu)、蝦等(deng)。

（2）實驗(yan)中必(bi)須使(shi)用(yong)壹次性(xing)吸頭(tou)，在(zai)吸取不(bu)同(tong)的(de)試劑(ji)時(shi)要(yao)更換(huan)吸頭(tou)。

（3）實驗前須檢查(zha)各種實(shi)驗器(qi)具是否幹(gan)凈，必(bi)要時(shi)對(dui)實驗(yan)器(qi)具進(jin)行(xing)清潔，以(yi)避(bi)免(mian)汙染幹(gan)擾(rao)實驗結(jie)果。

樣本前處理步驟：

該方(fang)法(fa)為(wei)氯(lv)黴(mei)素(su)和硝(xiao)基呋喃類(lei)四(si)項(xiang)同(tong)時(shi)檢測的(de)五合壹前處理方法(fa)；用(yong)本方(fang)法制備出的(de)樣品提(ti)取溶(rong)液(ye)可(ke)以(yi)直(zhi)接同(tong)時(shi)應(ying)用(yong)於本(ben)公(gong)司研發(fa)的(de)氯(lv)黴(mei)素(su)和呋喃唑酮(tong)代(dai)謝(xie)物(wu)、呋喃它酮代(dai)謝(xie)物(wu)、呋喃妥(tuo)因(yin)代謝(xie)物、呋喃西(xi)林代謝(xie)物(wu)檢測試(shi)劑(ji)盒。(備註(zhu)：使(shi)用(yong)該五(wu)合壹前處理方法(fa)檢測氯(lv)黴(mei)素(su)時(shi)，因(yin)存在(zai)壹定的(de)幹(gan)擾(rao)；樣本檢測下(xia)限(xian)為(wei)0.3ppb）

(a) 水(shui)產、組(zu)織、蜂蜜(mi)

1、 取(qu)2±0.05g均(jun)質(zhi)樣本樣本，加(jia)入(ru) 4ml的(de)去離(li)子(zi)水(shui)，0.5ml1M HCl和100µl衍生化試劑(ji)，充(chong)分(fen)振(zhen)蕩(dang)。

2、 置(zhi)於(yu)37℃恒(heng)溫(wen)箱孵(fu)育過夜（大約(yue)16h）或(huo)90℃水(shui)浴中(zhong)孵育20min；

3、 分(fen)別(bie)加(jia)入(ru)5ml 0.1M K₂HPO_4， 0.4 ml 1M NaOH和5ml乙酸(suan)乙酯(zhi)，充(chong)

          分(fen)振(zhen)蕩(dang)2min；

4、 在室(shi)溫(wen)下（20-25℃）4000r/min以(yi)上(shang)離(li)心5min。

5、 取出(chu)2.5ml上(shang)層(ceng)清亮(liang)液體(ti)到(dao)另(ling)壹(yi)潔(jie)凈離心管(guan)中(zhong)，於(yu)65℃氮氣(qi)/空(kong)

氣(qi)吹幹(gan)。

6、 用(yong)1ml正己烷溶(rong)解(jie)幹(gan)燥物，加(jia)入(ru)1ml已(yi)稀(xi)釋好的(de)復溶(rong)液(ye)充(chong)分(fen)混合

30s；在(zai)室(shi)溫(wen)下（20-25℃）4000r/min以(yi)上(shang)離(li)心5min。

7、 取50µl下層(ceng)用(yong)於分(fen)析。

樣本稀(xi)釋倍(bei)數：1

(b) 特殊樣本(畜(chu)禽產(chan)品組織、肝臟、腸衣(yi)、油(you)炸食(shi)品(pin)、混合肉餡、熟食等(deng))的(de)處理方法(fa)

1、 取(qu)2±0.05g的(de)均(jun)質(zhi)樣本於(yu)50ml離心管(guan)中(zhong)，6ml的(de)去離(li)子(zi)水(shui)，充(chong)分(fen)振(zhen)蕩(dang)2min，加(jia)入(ru)5ml正(zheng)己(ji)烷，充(chong)分(fen)混合震(zhen)蕩(dang)3min,4000r/min離心10min。

2、 棄(qi)除(chu)上(shang)層(ceng)有機相(xiang)液體(ti)，吸取4ml下(xia)層(ceng)清澈液(ye)體(ti)於另(ling)壹(yi)個50ml離心管(guan)中(zhong)，加(jia)0.5ml1M HCl和100µl衍生(sheng)化試劑(ji)，充(chong)分(fen)振(zhen)蕩(dang)。

3、 置(zhi)於(yu)37℃過(guo)夜孵(fu)育（大約(yue)16h）或(huo)90℃水(shui)浴中(zhong)孵育20min；

4、 分(fen)別(bie)加(jia)入(ru)5ml 0.1M K₂HPO_4， 0.4 ml 1M NaOH和5ml乙酸(suan)乙酯(zhi)，充(chong)分(fen)振(zhen)蕩(dang)2min；在室(shi)溫(wen)下（20-25℃）4000r/min以(yi)上(shang)離(li)心5min。

5、 取(qu)出2.5ml上(shang)層(ceng)清亮(liang)液體(ti)到(dao)另(ling)壹(yi)潔(jie)凈離心管(guan)中(zhong)，於(yu)65℃氮氣(qi)  /空(kong)氣(qi)吹幹(gan)。

6、 用(yong)1ml正己烷溶(rong)解(jie)幹(gan)燥物，加(jia)入(ru)1ml已(yi)稀(xi)釋好的(de)復溶(rong)液(ye)充(chong)分(fen)混合30s，在(zai)室(shi)溫(wen)下（20-25℃）4000r/min以(yi)上(shang)離(li)心5min。

7、 取出(chu)50µl下(xia)層(ceng)用(yong)於分(fen)析。

        樣本稀(xi)釋倍(bei)數：2

【酶(mei)標免(mian)疫分(fen)析程序】

操(cao)作(zuo)步驟：

1、 從(cong)4℃冷(leng)藏環(huan)境中(zhong)取(qu)出(chu)所(suo)需試劑(ji)，置(zhi)室(shi)溫(wen)（20-25℃）平衡30min以(yi)上(shang)，註(zhu)意(yi)每(mei)種液(ye)體試劑(ji)使(shi)用(yong)前均(jun)須(xu)搖(yao)勻(yun)。

2、 取出(chu)需要數量的(de)微(wei)孔(kong)及框架(jia)，將不(bu)用(yong)的(de)微(wei)孔(kong)放入(ru)自封(feng)袋(dai)，保(bao)存(cun)於(yu)2-8℃。

3、 編號：將樣本和標準(zhun)品(pin)對應(ying)微(wei)孔(kong)按序編號(hao)，每(mei)個樣本和標準(zhun)品(pin)做2孔平行(xing)，並記(ji)錄標準(zhun)孔(kong)和樣本孔(kong)所(suo)在的(de)位置(zhi)。

4、 加(jia)標準(zhun)品(pin)/樣本 50µl/孔(kong)到(dao)各自(zi)的(de)微(wei)孔(kong)中，加(jia)入(ru)酶標記(ji)物(wu)50µl/孔,然後(hou)加(jia)入(ru)抗(kang)體(ti)50µl/孔(kong)，用(yong)蓋板膜封板，輕(qing)輕(qing)震蕩(dang)混勻(yun)。25℃環(huan)境中(zhong)反(fan)應(ying)30min。

5、 取出將孔內(nei)液(ye)體甩(shuai)幹(gan)，用(yong)洗(xi)液250µl/孔(kong)洗(xi)板4-5次，每(mei)次間隔(ge)15-30秒，用(yong)吸水紙(zhi)墊(dian)好後(hou)拍幹(gan)（拍幹(gan)後(hou)未被清除的(de)氣(qi)泡可(ke)用(yong)幹(gan)凈的(de)槍頭(tou)刺破）。

6、 顯色：每(mei)孔加(jia)入(ru)底物(wu)A液50µl，再(zai)加(jia)底物(wu)B液(ye)50µl，輕(qing)輕(qing)振(zhen)蕩(dang)混勻(yun)，25℃環(huan)境中(zhong)避(bi)光(guang)顯色15min。

7、 測(ce)定：每(mei)孔加(jia)入(ru)終(zhong)止液(ye)50µl，輕(qing)輕(qing)振(zhen)蕩(dang)混勻(yun)，設(she)定酶(mei)標儀(yi)於(yu)450nm處（建議用(yong)雙波長(chang)450/630nm檢測，在(zai)5min內(nei)讀完數據），測(ce)定每(mei)孔OD值(zhi)。

【結(jie)果判定】  

結果判定有兩種方(fang)法，粗略(lve)判(pan)定可(ke)用(yong)第1種方(fang)法，定量判(pan)定用(yong)第2種方(fang)法。註(zhu)意(yi)樣本吸光(guang)值(zhi)與(yu)AOZ的(de)含量成(cheng)負相關(guan)。

1、粗(cu)略(lve)判(pan)定：

用(yong)樣品的(de)平均(jun)吸光(guang)度(du)值(zhi)與(yu)標準(zhun)值(zhi)比(bi)較即(ji)可(ke)得出樣本所(suo)含AOZ濃度(du)範圍（ng/ml）。假(jia)設(she)樣品1的(de)吸光(guang)度(du)值(zhi)為(wei)0.268，樣品2的(de)吸光(guang)度(du)值(zhi)為(wei)1.230，標準(zhun)液(ye)吸光(guang)度(du)值(zhi)分(fen)別(bie)是：0ppb為1.671；0.02ppb為(wei)1.425；0.06ppb為1.103； 0.18ppb為0.567； 0.54ppb為(wei)0.205； 1.62ppb為0.104。則樣品1的(de)濃度(du)範圍是0.18ppb-0.54ppb；樣品2的(de)濃度(du)範圍是0.02ppb-0.06ppb。乘以(yi)其(qi)對應(ying)的(de)稀釋倍(bei)數即為(wei)樣本中(zhong)AOZ實際(ji)濃度(du)。

2、定量判(pan)定：

   所(suo)獲(huo)得的(de)每(mei)個濃度(du)標準(zhun)溶(rong)液(ye)和樣本吸光(guang)度(du)值(zhi)的(de)平均(jun)值(zhi)（B）除(chu)以(yi)第(di)壹(yi)個標準(zhun)（0標準(zhun)）的(de)吸光(guang)度(du)值(zhi)（B₀）再乘以(yi)100%，即(ji)百分(fen)吸光(guang)度(du)值(zhi).

B—標準(zhun)溶(rong)液(ye)或樣本溶(rong)液(ye)的(de)平均(jun)吸光(guang)度(du)值(zhi)

B₀—0ng/ml標準(zhun)溶(rong)液(ye)的(de)平均(jun)吸光(guang)度(du)值(zhi)

以(yi)標準(zhun)品(pin)百分(fen)吸光(guang)率為(wei)縱(zong)坐標，以(yi)AOZ標準(zhun)品(pin)濃度(du)（ng/ml）的(de)半(ban)對數為橫(heng)坐標，繪制(zhi)標準(zhun)曲(qu)線(xian)圖(tu)。將樣本的(de)百分(fen)吸光(guang)率代(dai)入(ru)標準(zhun)曲(qu)線(xian)中，從(cong)標準(zhun)曲(qu)線(xian)上讀出樣本所(suo)對應(ying)的(de)濃度(du)，乘以(yi)其(qi)對應(ying)的(de)稀釋倍(bei)數即為(wei)樣本中(zhong)AOZ實際(ji)濃度(du)。

若(ruo)利(li)用(yong)試劑(ji)盒專業(ye)分(fen)析軟件進(jin)行(xing)計(ji)算(suan)，更(geng)便(bian)於(yu)大量樣品的(de)準確、快(kuai)速(su)分(fen)析。

3、標準(zhun)準(zhun)曲(qu)線(xian)：

     B/B0 (%)

        0.02     0.06       0.18       0.54       1.62

AOZ(ppb) [µg/kg]

圖(tu)1： 呋喃唑酮(tong)代(dai)謝(xie)物(wu)檢測試(shi)劑(ji)盒的(de)回歸(gui)曲(qu)線(xian)

4、再(zai)現性(xing)：

      %CV

           0    0.02     0.06     0.18    0.54     1.62

AOZ(ppb) [µg/kg]

      圖(tu)2：呋喃唑酮(tong)代(dai)謝(xie)物(wu)檢測試(shi)劑(ji)盒的(de)精密度(du)

由多(duo)個不(bu)同(tong)的(de)實驗結果確定了(le)精密度(du)，圖(tu)2顯示出(chu)呋喃唑酮(tong)代(dai)謝(xie)物(wu)檢測試(shi)劑(ji)盒的(de)精密度(du)情況，獲(huo)得的(de)標準(zhun)吸收值(zhi)的(de)變(bian)異(yi)系(xi)數（%CV）對相(xiang)應(ying)呋喃唑酮(tong)濃度(du)作曲(qu)線(xian)，可(ke)以(yi)看到(dao)在(zai)全部(bu)範圍內(nei)變(bian)異(yi)系(xi)數如(ru)此(ci)之低(di)，可(ke)以(yi)得到(dao)很(hen)好的(de)再現性(xing)。

【註(zhu)意(yi)事項(xiang)】  

1、 使(shi)用(yong)前將所(suo)有試劑(ji)溫(wen)度(du)回升至(zhi)室(shi)溫(wen)20-25℃。試劑(ji)及(ji)標本(ben)沒(mei)有回到(dao)室(shi)溫(wen)（20-25℃）會導(dao)致(zhi)所(suo)有標準(zhun)的(de)OD值(zhi)偏低。

2、 在(zai)洗(xi)板過(guo)程中如(ru)果出現板孔(kong)幹(gan)燥的(de)情況，則(ze)會伴隨(sui)著(zhe)出現標準(zhun)曲(qu)線(xian)不(bu)成線(xian)性(xing)，重復性(xing)不(bu)好的(de)現象。所(suo)以(yi)洗(xi)板拍(pai)幹(gan)後(hou)應立(li)即進(jin)行(xing)下(xia)壹(yi)步操(cao)作(zuo)。

3、 混合要均(jun)勻(yun)，否則會出現重復性(xing)不(bu)好的(de)現象。

4、 反(fan)應(ying)終(zhong)止液(ye)為2M硫(liu)酸(suan)，避免接觸(chu)皮膚。

5、 不(bu)要使(shi)用(yong)過了(le)有效(xiao)日期(qi)的(de)試劑(ji)盒，稀(xi)釋(shi)或攙雜使(shi)用(yong)會引起(qi)靈敏(min)度(du)、OD值(zhi)的(de)變(bian)化。不(bu)要交換使(shi)用(yong)不(bu)同(tong)批號(hao)的(de)盒中(zhong)試(shi)劑(ji)。

6、 不(bu)用(yong)的(de)微(wei)孔(kong)板放(fang)進(jin)自(zi)封(feng)袋(dai)密封(feng)；標準(zhun)物(wu)質(zhi)和無(wu)色的(de)發(fa)色劑(ji)對(dui)光(guang)敏感(gan)，因(yin)此要(yao)避免(mian)直(zhi)接暴(bao)露在(zai)光(guang)線下(xia)。

7、 顯色液若(ruo)有任何顏色表(biao)明(ming)變(bian)質(zhi)，應(ying)當(dang)棄(qi)之。0標準(zhun)的(de)吸光(guang)度(du)值(zhi)小(xiao)於0.5個單位(wei)（A_450nm< 0.5 ）時(shi)，表(biao)示試(shi)劑(ji)可(ke)能(neng)變(bian)質(zhi)。

8、 該試劑(ji)盒最(zui)佳反應(ying)溫(wen)度(du)為25℃，溫(wen)度(du)過高(gao)或(huo)過低(di)將導(dao)致(zhi)檢測吸光(guang)度(du)值(zhi)和靈敏(min)度(du)發(fa)生(sheng)變(bian)化。

【儲存(cun)】

原包(bao)裝應儲存(cun)於2～8℃保(bao)鮮(xian)冷(leng)藏，切(qie)勿(wu)冷(leng)凍(dong)。

【有效(xiao)期(qi)】

有效(xiao)期(qi)12個月;生產(chan)日期(qi)、有效(xiao)期(qi)、生產(chan)批號(hao)見外(wai)包(bao)裝。