氧氟(fu)沙星ELISA快速(su)檢(jian)測(ce)試(shi)劑盒(he)說明書

氧氟(fu)沙星快速(su)檢(jian)測(ce)試(shi)劑盒(he)

使(shi)用說明書

        試(shi)劑盒(he)采用間接競爭(zheng)ELISA方(fang)法(fa)，在(zai)微(wei)孔條上預包被偶(ou)聯(lian)抗(kang)原(yuan)，樣(yang)本(ben)中(zhong)的殘(can)留(liu)物氧氟(fu)沙星和(he)微(wei)孔條上預包被的(de)偶(ou)聯抗(kang)原(yuan)競爭(zheng)抗(kang)氧氟(fu)沙星抗(kang)體(ti)，加入酶標記物(wu)後，用TMB底物(wu)顯(xian)色，樣(yang)本(ben)吸(xi)光(guang)值(zhi)與(yu)其所(suo)含(han)殘(can)留(liu)氧氟(fu)沙星的含(han)量(liang)成負相關(guan)，與(yu)標準(zhun)曲線比(bi)較(jiao)即可(ke)得(de)出相應(ying)殘(can)留物(wu)氧氟(fu)沙星的含(han)量(liang)。

規       格：96孔/盒

靈 敏 度： 2ppb

檢(jian)測(ce)時(shi)間(jian)： 45min

反應(ying)率

氧氟(fu)沙星………………………………100％

樣(yang)本(ben)回(hui)收(shou)率

組   織(zhi)…………………………………80±15%

血(xue)   清…………………………………80±15%

蜂   蜜 ……………………………… 75±15%

檢(jian)測(ce)下限

組   織(zhi)…………………………………2ppb

血(xue)   清…………………………………4ppb

蜂   蜜 ……………………………… 4ppb

牛  奶 ……………………………… 80ppb

【試(shi)劑盒(he)組成】   

1、 微(wei)量(liang)測試(shi)孔：每條8孔，壹板12條

2、 標準(zhun)液×6瓶(ping)：（1ml/瓶(ping)） 0ppb、2ppb、6 ppb、18ppb、54ppb、162ppb

3、 高(gao)濃(nong)度(du)標準(zhun)品溶(rong)液(ye)×1瓶(ping)：（1ml/瓶(ping)） 1ppm

4、 酶標記物(wu)           7 ml………………………………… 紅色帽(mao)

5、 抗(kang)體(ti)工(gong)作(zuo)液        7 ml………………………………… 綠色帽(mao)

6、 底物(wu)A液            7ml……………………………………棕色帽(mao)

7、 底物(wu)B液　      7ml……………………………………黑色帽(mao)

8、 終止(zhi)液(ye)               7ml……………………………………黃色帽(mao)

9、 20X濃縮(suo)洗(xi)滌(di)液40 ml ……………………………… 白(bai)色帽

10、 2X濃縮(suo)復溶(rong)液(ye)    50 ml …………………………………藍色帽(mao)

【所用儀器(qi)、試(shi)劑】   

具備(bei)的(de)儀(yi)器(qi)：微(wei)孔酶標儀、打印機(ji)、均(jun)質(zhi)器(qi) 、氮(dan)氣吹幹(gan)裝(zhuang)置、振蕩器(qi)、離(li)心機、刻度移液(ye)管(guan)、天(tian)平（感量0.01g）

微(wei)量(liang)移液(ye)器(qi)：單道(dao)20µl-200µl、100µl-1000µl，多(duo)道250µl

試(shi)         劑：濃鹽(yan)酸(suan)、二氯(lv)甲(jia)烷(wan)、正(zheng)己烷、乙腈(jing)、肝(gan)素(su)鈉

                     Na₂HPO₄·12H₂O、NaH₂PO₄·2H₂O、

【實驗(yan)前(qian)溶(rong)液(ye)配制(zhi)】

配液(ye)1、0.1M HCL溶(rong)液(ye)  

860µl濃鹽(yan)酸(suan)加去(qu)離子水(shui)100ml溶(rong)解(jie)。

配液(ye)2、乙腈(jing)-0.1MHCL溶(rong)液(ye)

V_乙腈(jing)：V_{0.1M –HCL} ＝ 84：16

配液(ye)3、乙腈(jing)-二氯(lv)甲(jia)烷(wan)混合(he)溶(rong)液(ye)

V_乙腈(jing)-V_{二氯(lv)甲(jia)烷(wan)}  =  1 : 4

配液(ye)4、pH7.2  0.05M PB緩沖(chong)液

12.9gNa₂HPO₄·12H₂O+2.175gNaH₂PO₄·2H₂O

             加去(qu)離子水(shui)1L溶(rong)解(jie)。

配液(ye)5、pH7.2   0.02MPB緩沖(chong)液

 5.16gNa₂HPO₄·12H₂O+0.87g NaH₂PO₄·2H₂O

 加去(qu)離子水(shui)1L溶(rong)解(jie)。

配液(ye)6、用去(qu)離子水(shui)將(jiang)2X濃縮(suo)復溶(rong)液(ye)按(an)1：1稀釋

（1份濃(nong)縮(suo)復溶(rong)液(ye)+1份去(qu)離子水(shui)）用於樣(yang)本(ben)復溶(rong)。

配液(ye)7：將(jiang)40ml濃縮(suo)洗(xi)滌(di)液（20倍(bei)濃(nong)縮）用去(qu)離子水(shui)按照1：19

               稀釋（1份濃(nong)縮(suo)洗(xi)滌(di)液+19份去(qu)離子水(shui)），或(huo)按(an)所(suo)需用量

               配制(zhi)洗(xi)滌(di)液。

【樣(yang)本(ben)前(qian)處理步驟】   

樣(yang)本(ben)前(qian)處理須知(zhi)：處理任(ren)何(he)樣(yang)本(ben)時(shi)，都(dou)必須註(zhu)意(yi)：

（a）本(ben)試(shi)劑盒(he)所檢(jian)測(ce)的組(zu)織(zhi)樣(yang)本(ben)包括(kuo)：動物(wu)組(zu)織(zhi)、禽(qin)類和(he)水(shui)產組織(zhi)。eg:雞、鴨(ya)、牛、兔(tu)、魚、蝦、蛋類等(deng)。

（b）實驗(yan)中(zhong)必須使(shi)用壹次性吸(xi)頭，在吸(xi)取(qu)不(bu)同的試(shi)劑時(shi)要(yao)更換(huan)吸(xi)頭。

（c）實驗(yan)之(zhi)前(qian)須檢(jian)查(zha)各種(zhong)實(shi)驗器(qi)具(ju)是(shi)否幹凈，必要(yao)時(shi)可(ke)對實驗器(qi)具(ju)進行清潔(jie)，以避免汙(wu)染幹(gan)擾實驗結果(guo)。

樣(yang)本(ben)前(qian)處理方(fang)法(fa)：

（a）組織(zhi)/蛋類(lei)樣(yang)本(ben)（雞(ji)肉/肝(gan)、豬(zhu)肉/肝(gan)、蝦、魚、蛋類等）

1、 稱(cheng)2.0±0.05g 均(jun)質(zhi)樣(yang)本(ben)於50ml離心管中(zhong)；

2、 加入乙腈(jing)-二氯(lv)甲(jia)烷(wan)混合(he)溶(rong)液(ye)8ml，振蕩5min，4000r/min以上，15℃離心10min；

3、 取4ml清澈有(you)機相至(zhi)幹(gan)燥溶(rong)器(qi)中(zhong)，56℃氮(dan)氣吹幹(gan)/旋(xuan)轉蒸發(fa)至幹；

4、 用1ml稀釋後的復溶(rong)液(ye)溶(rong)解(jie)幹(gan)燥的殘留物(wu)，加入正(zheng)己烷1ml混合(he)30s，4000r/min以上，15℃離心5min；

5、 去(qu)除上層取(qu)下(xia)層50µl液體(ti)用於分析(xi)。

         樣(yang)本(ben)稀釋倍(bei)數(shu)：1

（b） 組織(zhi)/蛋類(lei)低(di)檢(jian)測(ce)限處理方(fang)法(fa)

1、稱(cheng)取2.0±0.05g均(jun)質(zhi)過的組(zu)織(zhi)樣(yang)本(ben)於50ml離心管中(zhong)；加入4ml 0.02M  PB緩沖(chong)液，充分振蕩2min，於15℃，4000r/min以上速(su)度離(li)心10min

2、取50µl液體(ti)與450µl稀釋後的復溶(rong)液(ye)

2、取50µl液體(ti)用於分析(xi)。

樣(yang)本(ben)稀釋倍(bei)數(shu)：20倍(bei)

（c）血(xue)清樣(yang)本(ben)的(de)處理

1、 用加有肝(gan)素(su)鈉（20-30單位(wei)/ml血(xue)）的(de)離(li)心管采集血(xue)樣(yang)本(ben)（建議(yi)采(cai)血(xue)註(zhu)射(she)器(qi)也用肝(gan)素(su)鈉潤(run)洗(xi)），血(xue)樣(yang)本(ben)室(shi)溫靜(jing)置(zhi)1h，待析(xi)出血(xue)漿(jiang)後(hou)4000r/min以上，15℃離心10min，取出血(xue)漿(jiang)1ml；

2、 加入乙腈(jing)（無水(shui)）4ml上下(xia)充(chong)分混合(he)5min，4000r/min以上，15℃離心10min；

3、 移上(shang)清至(zhi)另(ling)壹離(li)心管中(zhong)，加入2ml 0.02M PB緩沖(chong)液，混勻；

4、 加入二(er)氯(lv)甲(jia)烷(wan)5ml，充分混勻5min，4000r/min，15℃離心10min，去(qu)上層，取(qu)下(xia)層有(you)機(ji)相到(dao)幹(gan)燥瓶(ping)中(zhong)（清亮(liang)無雜質），50℃旋(xuan)轉蒸發(fa)至幹/氮(dan)氣吹幹(gan)；

5、 用1ml稀釋後的復溶(rong)液(ye)溶(rong)解(jie)幹(gan)燥的殘留物(wu)，加入正(zheng)己烷1ml混合(he)30s，4000r/min以上，15℃離心5min；

6、 輕(qing)吸(xi)掉(diao)上(shang)層和(he)中(zhong)間白(bai)色雜質，取下層相100µl加入100µl稀釋後的復溶(rong)液(ye)，混合(he)30s；

7、 取50µl用於分析(xi)。

        樣(yang)本(ben)稀釋倍(bei)數(shu)：2

（d）蜂蜜

1、 取1g蜂蜜，加６ml乙腈(jing)-0.1MHCL溶(rong)液(ye)振蕩至蜂蜜全部溶(rong)解(jie)；

2、 加入３ml 0.05M PB緩沖(chong)液，加入11ml二(er)氯(lv)甲(jia)烷(wan)，振蕩5min，4000r/min以上離(li)心5min；

3、 輕(qing)吸(xi)掉(diao)上(shang)層，取(qu)下(xia)層有(you)機(ji)相８ml至幹(gan)燥溶(rong)器(qi)中(zhong)，56℃氮(dan)氣吹幹(gan)；

4、 用1ml稀釋後的復溶(rong)液(ye)溶(rong)解(jie)幹(gan)燥的殘留物(wu)，再(zai)加入正(zheng)己烷1ml混合(he)30s，3000r/min以上，15℃離(li)心5min；

5、 去(qu)除上層取(qu)下(xia)層50µl液體(ti)用於分析(xi)。

        稀釋倍(bei)數(shu)：2

（e）牛奶(nai)

   1、取出50μl 牛奶(nai)於另(ling)壹試(shi)管中(zhong)，加入1950μl樣(yang)本(ben)稀釋液混30s；

2、取50µl液體(ti)用於分析(xi)。

樣(yang)本(ben)稀釋倍(bei)數(shu)：40倍(bei) 

【酶標免疫(yi)分析(xi)程(cheng)序(xu)】   

操作(zuo)步驟：

1、 將(jiang)試(shi)劑盒(he)從(cong)冷(leng)藏環(huan)境(jing)中(zhong)取出並(bing)將(jiang)所(suo)需試(shi)劑從(cong)試(shi)劑盒(he)取出，置室(shi)溫（20-25℃）平衡(heng)30min以上, 註意(yi)每種(zhong)液(ye)體(ti)試(shi)劑使(shi)用前(qian)均(jun)須搖勻。

2、 按需要(yao)取出微(wei)孔條及板架(jia)，將(jiang)不(bu)用的微(wei)孔板重(zhong)新密(mi)封，保存於2-8℃，不要(yao)冷(leng)凍(dong)。

3、 編(bian)號(hao)：將(jiang)樣(yang)本(ben)和(he)標準(zhun)品對應(ying)微(wei)孔按序(xu)編(bian)號(hao)，每個樣(yang)本(ben)和(he)標準(zhun)品均(jun)需做(zuo)2孔平行，並(bing)記錄標準(zhun)孔的樣(yang)本(ben)孔所在(zai)的位(wei)置。

4、 加標準(zhun)品/樣(yang)本(ben)50µl /孔，然後(hou)加入50µl/孔酶標記物(wu)；再(zai)加入50µl/孔抗(kang)體(ti)工(gong)作(zuo)液。輕(qing)輕(qing)振蕩混勻，用蓋板膜(mo)蓋(gai)板，25℃環(huan)境(jing)反應30min。

5、 取出用洗滌(di)液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸(jin)泡15-30秒(miao)，拍幹（拍幹後(hou)未被清除的氣泡可用幹凈的槍(qiang)頭刺(ci)破）。

6、 顯色：每孔加入底(di)物(wu)液A液50µl再加B液50µl，輕(qing)輕(qing)振蕩混勻，25℃環(huan)境(jing)避光顯色15min。

7、 測定：每孔加入終止(zhi)液(ye)50µl，輕(qing)輕(qing)振蕩混勻，設定酶(mei)標儀於450nm處（建議(yi)用雙(shuang)波(bo)長(chang)450/630nm檢(jian)測(ce)在5min內讀(du)完數(shu)據(ju)），測(ce)定吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)（OD值(zhi)）。

【結果(guo)判(pan)定】   

      結果(guo)判(pan)定有(you)兩種(zhong)方(fang)法(fa)，粗略(lve)判(pan)定可(ke)用第(di)1種(zhong)方(fang)法(fa)，定量(liang)判(pan)定用第(di)2種(zhong)方(fang)法(fa)。註(zhu)意(yi)樣(yang)本(ben)吸(xi)光(guang)值(zhi)與(yu)氧氟(fu)沙星的含(han)量(liang)成負相關(guan)。

1、粗略(lve)判(pan)定

用樣(yang)本(ben)的(de)平均(jun)吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)與(yu)標準(zhun)品比較(jiao)即可(ke)得(de)出其濃(nong)度範(fan)圍(wei)(ng/ml)。假(jia)設樣(yang)本(ben)1的吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)為0.238， 樣(yang)本(ben)2的吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)為0.746，標準(zhun)液吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)分別(bie)是：0ppb為1.645； 2ppb為1.242；6ppb為0.830； 18ppb為0.535；54ppb為0.306； 162ppb為0.176。則樣(yang)本(ben)1的濃(nong)度(du)範(fan)圍是54ppb-162ppb；樣(yang)本(ben)2的濃(nong)度(du)範(fan)圍是6ppb-18ppb。乘(cheng)以其對(dui)應的稀釋倍(bei)數(shu)即為樣(yang)本(ben)中(zhong)氧氟(fu)沙星的實(shi)際(ji)濃(nong)度。

2、定量(liang)分析(xi)

（1）百分吸(xi)光(guang)率的計(ji)算，標準(zhun)品或(huo)樣(yang)本(ben)的(de)百分吸(xi)光(guang)率等於標準(zhun)品或(huo)樣(yang)本(ben)的(de)百分吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)的(de)平均(jun)值(zhi)（雙(shuang)孔）除以第(di)壹(yi)個標準(zhun)（0標準(zhun)）的吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)，再(zai)乘(cheng)以100%，即

B—標準(zhun)溶(rong)液(ye)或(huo)樣(yang)本(ben)溶(rong)液(ye)的(de)平(ping)均(jun)吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)

B₀—0ng/ml標準(zhun)溶(rong)液(ye)的(de)平(ping)均(jun)吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)

（2）標準(zhun)曲線的(de)繪(hui)制(zhi)與(yu)計(ji)算

以標準(zhun)品百分吸(xi)光(guang)率為縱坐標，以氧氟(fu)沙星標準(zhun)品濃度(du)（ng/ml）的半對(dui)數(shu)為橫(heng)坐標，繪(hui)制(zhi)標準(zhun)曲線圖(tu)。將(jiang)樣(yang)本(ben)的(de)百分吸(xi)光(guang)率代入標準(zhun)曲線中(zhong)，從(cong)標準(zhun)曲線上(shang)讀(du)出樣(yang)本(ben)所(suo)對應(ying)的濃(nong)度(du)，乘(cheng)以其對(dui)應的稀釋倍(bei)數(shu)即為樣(yang)本(ben)中(zhong)氧氟(fu)沙星的實(shi)際(ji)濃(nong)度。

若(ruo)利(li)用試(shi)劑盒(he)專業分析(xi)軟(ruan)件(jian)進行計(ji)算，更(geng)便(bian)於大量樣(yang)本(ben)的(de)準(zhun)確、快速(su)分析(xi)。（歡迎來電索取(qu)）

3、標準(zhun)準(zhun)曲線：

B/B0 (%)

           2                   6                    18                 54               162

 (ppb) [µg/kg]

圖(tu)1：氧氟(fu)沙星檢(jian)測(ce)試(shi)劑盒(he)的回(hui)歸曲(qu)線

4、再現(xian)性：

 %CV 

            0        2      6        18     54     162

                   (ppb) [µg/kg]

圖(tu)2：氧氟(fu)沙星檢(jian)測(ce)試(shi)劑盒(he)的精密(mi)度

由(you)多(duo)個不同的實驗結(jie)果(guo)確定了精密(mi)度，圖(tu)2顯示出氧氟(fu)沙星檢(jian)測(ce)試(shi)劑盒(he)的精密(mi)度情(qing)況，獲(huo)得(de)的(de)標準(zhun)吸(xi)收(shou)值(zhi)的(de)變異(yi)系數(shu)（%CV）對相應(ying)氧氟(fu)沙星濃度(du)作(zuo)曲(qu)線，可(ke)以看到(dao)在全部(bu)範(fan)圍(wei)內變異(yi)系數(shu)如此之(zhi)低(di)，可以得到(dao)很好(hao)的(de)再(zai)現性。

【註意(yi)事(shi)項】   

1、 使用前(qian)將(jiang)所(suo)有(you)試(shi)劑溫(wen)度回(hui)升(sheng)至(zhi)室(shi)溫(wen)20-25℃。試(shi)劑及標本(ben)沒(mei)有回(hui)到室(shi)溫(wen)（20-25℃）會(hui)導(dao)致所有標準(zhun)的OD值(zhi)偏(pian)低(di)。

2、 在洗(xi)板過(guo)程(cheng)中(zhong)如果(guo)出現板孔幹燥的情(qing)況，則會(hui)伴(ban)隨著(zhe)出現標準(zhun)曲線不(bu)成線性，重(zhong)復性不好(hao)的(de)現(xian)象。所以洗板拍幹後(hou)應立(li)即進行下(xia)壹(yi)步操作。

3、 混合(he)要(yao)均(jun)勻，否則會(hui)出現重(zhong)復性不好(hao)的(de)現(xian)象。

4、 反應(ying)終止(zhi)液(ye)為2M硫(liu)酸(suan)，避免接觸皮(pi)膚。

5、 不要(yao)使用過了有效日(ri)期(qi)的試(shi)劑盒(he)，稀釋或(huo)攙雜使用會(hui)引起靈敏度、OD值(zhi)的(de)變化。不要(yao)交換(huan)使(shi)用不同批號的(de)盒中(zhong)試(shi)劑。

6、 不用的微(wei)孔板放(fang)進自封(feng)袋密(mi)封；標準(zhun)物質(zhi)和(he)無色的(de)發(fa)色劑(ji)對(dui)光(guang)敏感，因此(ci)要(yao)避免直接暴露(lu)在(zai)光(guang)線下(xia)。

7、 顯色液(ye)若(ruo)有(you)任(ren)何(he)顏(yan)色表明變質，應(ying)當棄之(zhi)。0標準(zhun)的吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)小(xiao)於0.5個單位(wei)（A_450nm< 0.5 ）時(shi)，表示試(shi)劑可(ke)能變(bian)質(zhi)。

8、 該試(shi)劑盒(he)最佳反(fan)應(ying)溫度(du)為25℃，溫度(du)過(guo)高(gao)或(huo)過(guo)低(di)將(jiang)導(dao)致檢(jian)測(ce)吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)和(he)靈敏度發(fa)生變(bian)化。

【儲存(cun)】

原(yuan)包裝(zhuang)應儲(chu)存(cun)於2～8℃保鮮冷(leng)藏，切(qie)勿冷(leng)凍(dong)。

【有效期】

有效期12個月(yue);生產日(ri)期(qi)、有效期、生產批號見(jian)外包裝(zhuang)。