諾(nuo)氟沙(sha)星ELISA快(kuai)速檢(jian)測試劑(ji)盒簡介(jie)

                                 諾氟沙(sha)星快(kuai)速檢(jian)測試劑(ji)盒

                                            使(shi)用(yong)說(shuo)明(ming)書

【原(yuan)理(li)】

試(shi)劑(ji)盒采用(yong)間接競(jing)爭(zheng)ELISA方法，在(zai)微(wei)孔條上(shang)預(yu)包被偶聯(lian)抗(kang)原，樣(yang)本(ben)中(zhong)的(de)殘(can)留物諾(nuo)氟沙(sha)星和微(wei)孔條上(shang)預(yu)包被的(de)偶聯(lian)抗(kang)原競(jing)爭(zheng)抗(kang)諾氟沙(sha)星抗(kang)體，加入(ru)酶(mei)標(biao)記物後(hou)，用(yong)TMB底(di)物顯(xian)色(se)，樣本(ben)吸光(guang)值(zhi)與其所含殘留(liu)諾(nuo)氟沙(sha)星的(de)含量成(cheng)負相關，與標準(zhun)曲(qu)線比較即(ji)可得(de)出(chu)相(xiang)應(ying)殘(can)留(liu)物諾(nuo)氟沙(sha)星的(de)含量。

【試(shi)劑(ji)盒技術指(zhi)標】   

規(gui)       格：96孔/盒

靈(ling) 敏(min) 度(du)： 0.1ppb

檢(jian)測時間： 45min

樣(yang)本(ben)定量檢(jian)測下限(xian)：  

組(zu)   織(zhi)………………………………………0.1ppb

蜂   蜜(mi)………………………………………0.2ppb

血(xue)   清(qing)………………………………………0.2ppb

樣(yang)本(ben)回收(shou)率(lv)

組(zu)   織(zhi)…………………………………80±15%

血(xue)   清(qing)…………………………………80±15%

蜂   蜜(mi) ……………………………… 75±15%

諾(nuo)氟沙(sha)星反應(ying)率(lv)

諾(nuo)氟沙(sha)星（ENR）………………………100％

【試(shi)劑(ji)盒組成(cheng)】   

1、 微(wei)量測試孔：每(mei)條8孔，壹(yi)板12條

2、 標(biao)準(zhun)液(ye)×6瓶(ping)：（1ml/瓶(ping)） 0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb

3、 高(gao)濃度(du)標準(zhun)品(pin)溶(rong)液(ye)×1瓶(ping)：（1ml/瓶(ping)）100ppb

4、 酶(mei)標(biao)記物               7ml……………………………紅(hong)色(se)帽

5、 抗(kang)體工(gong)作(zuo)液(ye)          7ml……………………………綠色(se)帽

6、 底(di)物A液(ye)              7ml……………………………棕色(se)帽

7、 底(di)物B液(ye)　          7ml……………………………黑(hei)色(se)帽

8、 終(zhong)止液(ye)                  7ml……………………………黃(huang)色(se)帽

9、 20X濃縮(suo)洗滌液40ml ……………………………白(bai)色(se)帽

10、 2X濃縮(suo)復溶液   50 ml ……………………………藍(lan)色(se)帽

【所(suo)用(yong)儀器、試劑】   

具備(bei)的(de)儀器：微(wei)孔酶(mei)標(biao)儀、打印(yin)機、均(jun)質(zhi)器 、氮(dan)氣(qi)吹(chui)幹(gan)裝置(zhi)、振蕩器、離(li)心機、刻度移(yi)液管(guan)、天(tian)平(ping)（感量0.01g）

微(wei)量移(yi)液器(qi)：單(dan)道(dao)20µl-200µl、100µl-1000µl，多道250µl

試(shi)         劑(ji)：濃鹽(yan)酸(suan)、二(er)氯(lv)甲烷、正(zheng)己(ji)烷(wan)、乙(yi)腈(jing)、肝素鈉(na)

                     Na₂HPO₄·12H₂O、NaH₂PO₄·2H₂O、

【實驗前(qian)溶(rong)液(ye)配(pei)制】

樣(yang)本(ben)處理前(qian)需(xu)配(pei)制：

配(pei)液(ye)1、0.1M HCL溶(rong)液(ye)  

860µl濃鹽(yan)酸(suan)加去(qu)離(li)子水100ml溶(rong)解(jie)。

配(pei)液(ye)2、乙(yi)腈(jing)-0.1MHCL溶(rong)液(ye)

V_{乙(yi)腈(jing)}：V_{0.1M –HCL} ＝ 84：16

配(pei)液(ye)3、乙(yi)腈(jing)-二(er)氯(lv)甲烷混合(he)溶(rong)液(ye)

V_{乙(yi)腈(jing)}-V_{二(er)氯(lv)甲烷}  =  1 : 4

配(pei)液(ye)4、pH7.2  0.05M PB緩沖(chong)液(ye)

12.9gNa₂HPO₄·12H₂O+2.175gNaH₂PO₄·2H₂O

             加去(qu)離(li)子水1L溶(rong)解(jie)。

配(pei)液(ye)5、pH7.2   0.02MPB緩沖(chong)液(ye)

 5.16gNa₂HPO₄·12H₂O+0.87g NaH₂PO₄·2H₂O

 加去(qu)離(li)子水1L溶(rong)解(jie)。

配(pei)液(ye)6、用(yong)去(qu)離(li)子水將2X濃縮(suo)復溶液按1：1稀(xi)釋(shi)

（1份(fen)濃縮(suo)復溶液+1份(fen)去(qu)離(li)子水）用(yong)於樣(yang)本(ben)復溶(rong)。

配(pei)液(ye)7、將40ml濃縮(suo)洗滌液（20倍濃縮(suo)）用(yong)去(qu)離(li)子水按(an)照1：19稀(xi)釋(shi)

        （1份(fen)濃縮(suo)洗滌液+19份(fen)去(qu)離(li)子水），或(huo)按(an)所(suo)需(xu)用(yong)量配(pei)制洗滌液。

【樣(yang)本(ben)前(qian)處理方法】   

樣(yang)本(ben)前(qian)處理須知(zhi)：處理任何樣(yang)本(ben)時，都必須註意：

（a）本(ben)試劑(ji)盒所檢(jian)測的(de)組(zu)織(zhi)樣(yang)本(ben)包括：動物組(zu)織(zhi)、

禽(qin)類和(he)水產(chan)組織(zhi)。eg:雞、鴨(ya)、牛(niu)、兔、魚(yu)、蝦等(deng)。

（b）實驗中(zhong)必須使(shi)用(yong)壹(yi)次(ci)性吸頭(tou)，在吸(xi)取不(bu)同的(de)試(shi)劑時要(yao)更換吸頭(tou)。

（c）實驗之前(qian)須(xu)檢(jian)查(zha)各種實驗器具是(shi)否(fou)幹(gan)凈(jing)，必要(yao)時可對實驗器具進行清潔，以避(bi)免汙染幹(gan)擾實驗結果(guo)。

樣(yang)本(ben)前(qian)處理步驟

（a）組(zu)織(zhi)樣(yang)本(ben)（雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚等(deng)）

1、 稱2.0±0.05g 均(jun)質(zhi)的(de)組(zu)織(zhi)樣(yang)本(ben)於50ml離(li)心管中(zhong)；

2、 加入(ru)乙(yi)腈(jing)-二(er)氯(lv)甲烷混合(he)溶(rong)液(ye)8ml，振蕩5min，4000r/min以(yi)上(shang)，15℃離(li)心10min；

3、 取4ml上(shang)層(ceng)清(qing)澈(che)有(you)機相(xiang)至幹(gan)燥溶(rong)器中(zhong)，56℃氮(dan)氣(qi)吹(chui)幹(gan)/旋轉(zhuan)蒸發至幹(gan)；

4、 用(yong)1ml稀(xi)釋(shi)後(hou)的(de)復(fu)溶液溶解(jie)幹(gan)燥的(de)殘(can)留物，加入(ru)正(zheng)己(ji)烷(wan)1ml混合(he)30s，4000r/min以(yi)上(shang)，15℃離(li)心5min；

5、 去(qu)除(chu)上(shang)層(ceng)取下(xia)層50µl液(ye)體(ti)用(yong)於分(fen)析(xi)。

         樣(yang)本(ben)稀釋(shi)倍數(shu)：1

（b）血(xue)清(qing)樣(yang)本(ben)的(de)處理

1、 用(yong)加有肝素鈉(na)（20-30單(dan)位/ml血(xue)）的(de)離(li)心管采集(ji)血(xue)樣(yang)本(ben)（建議(yi)采血(xue)註(zhu)射器(qi)也用(yong)肝素鈉(na)潤洗(xi)），血(xue)樣(yang)本(ben)室(shi)溫靜(jing)置(zhi)1h，待(dai)析(xi)出(chu)血(xue)漿(jiang)後(hou)4000r/min以(yi)上(shang)，15℃離(li)心10min，取出(chu)血(xue)漿(jiang)1ml；

2、 加入(ru)乙(yi)腈(jing)（無(wu)水）4ml上(shang)下(xia)充分(fen)混合(he)5min，4000r/min以(yi)上(shang)，15℃離(li)心10min；

3、 移(yi)上清(qing)至另(ling)壹(yi)離心管中(zhong)，加入(ru)2ml 0.02M PB緩沖(chong)液(ye)，混勻(yun)；

4、 加入(ru)二(er)氯(lv)甲烷5ml，充分(fen)混勻(yun)5min，4000r/min，15℃離(li)心10min，去(qu)上(shang)層(ceng)，取下(xia)層有(you)機相(xiang)到幹(gan)燥瓶(ping)

        中(zhong)（清亮無(wu)雜(za)質(zhi)），50℃旋轉(zhuan)蒸發至幹(gan)/氮(dan)氣(qi)吹(chui)幹(gan)；

5、 用(yong)1ml稀(xi)釋(shi)後(hou)的(de)復(fu)溶(rong)液(ye)溶(rong)解(jie)幹(gan)燥的(de)殘(can)留物，加入(ru)正(zheng)

        己(ji)烷(wan)1ml混合(he)30s，4000r/min以(yi)上(shang)，離(li)心5min；

6、 輕(qing)吸(xi)掉(diao)上層和中(zhong)間白色雜(za)質(zhi)，取下(xia)層相(xiang)100µl加入(ru)100µl稀(xi)釋(shi)後(hou)的(de)復(fu)溶液，混合(he)30s；

7、 取50µl用(yong)於分(fen)析(xi)。

        樣(yang)本(ben)稀釋(shi)倍數(shu)：2

（c）蜂蜜(mi)

1、 取1g蜂蜜(mi)，加６ml乙腈(jing)-0.1MHCL溶液(ye)振蕩至蜂蜜(mi)全(quan)部溶解(jie)；

2、 加入(ru)３ml 0.05M PB緩沖(chong)液(ye)，加入(ru)11ml二(er)氯(lv)甲烷，振蕩5min，4000r/min以上(shang)離心5min；

3、 輕(qing)吸(xi)掉(diao)上層，取下(xia)層有(you)機相(xiang)８ml至幹(gan)燥溶(rong)器中(zhong)，56℃氮氣吹(chui)幹(gan)；

4、 用(yong)1ml稀(xi)釋(shi)後(hou)的(de)復(fu)溶液溶解(jie)幹(gan)燥的(de)殘(can)留物，再加入(ru)正(zheng)己(ji)烷(wan)1ml混合(he)30s，3000r/min以上(shang)，15℃離心5min；

5、 去(qu)除(chu)上(shang)層(ceng)取下(xia)層50µl液(ye)體(ti)用(yong)於分(fen)析(xi)。

        稀(xi)釋(shi)倍數(shu)：2

註(zhu)：在(zai)使(shi)用(yong)國(guo)家規(gui)定最高殘(can)留xian量（100ppb）進(jin)行(xing)判(pan)定時，需(xu)進(jin)行(xing)10倍稀(xi)釋（1份(fen)樣本(ben)液+9份(fen)已(yi)稀(xi)釋(shi)好(hao)的(de)復(fu)溶液(ye)）。

【酶(mei)標(biao)免疫(yi)分(fen)析(xi)程序(xu)】   

操(cao)作(zuo)步(bu)驟：

1、 將試劑(ji)盒從冷藏環(huan)境中(zhong)取出(chu)並(bing)將所需(xu)試劑(ji)從試劑盒取出(chu)，置(zhi)室(shi)溫（20-25℃）平(ping)衡(heng)30min以(yi)上(shang), 註(zhu)意(yi)每(mei)種液體(ti)試劑(ji)使(shi)用(yong)前(qian)均(jun)須(xu)搖(yao)勻(yun)。

2、 按(an)需(xu)要(yao)取出(chu)微(wei)孔條及板(ban)架(jia)，將不(bu)用(yong)的(de)微(wei)孔板(ban)重(zhong)新密封，保存於2-8℃，不(bu)要(yao)冷凍。

3、 編號(hao)：將樣本(ben)和標(biao)準(zhun)品(pin)對(dui)應(ying)微(wei)孔按(an)序(xu)編號(hao)，每(mei)個(ge)樣(yang)本(ben)和標(biao)準(zhun)品(pin)均(jun)需(xu)做(zuo)2孔平(ping)行(xing)，並記錄(lu)標準(zhun)孔的(de)樣(yang)本(ben)孔所(suo)在(zai)的(de)位置(zhi)。

4、 加標(biao)準(zhun)品(pin)/樣(yang)本(ben)50µl /孔，然後(hou)加入(ru)50µl/孔酶(mei)標(biao)記物；再加入(ru)50µl/孔抗(kang)體工(gong)作(zuo)液(ye)。輕(qing)輕(qing)振蕩混勻(yun)，用(yong)蓋板(ban)膜蓋板(ban)，25℃環(huan)境(jing)反(fan)應30min。

5、 取出(chu)用(yong)洗滌液按(an)每(mei)孔250μl洗(xi)板(ban)4-5次(ci)，每(mei)次(ci)浸泡15-30秒(miao)，拍(pai)幹(gan)（拍(pai)幹(gan)後(hou)未(wei)被(bei)清(qing)除的(de)氣(qi)泡可用(yong)幹(gan)凈(jing)的(de)槍頭(tou)刺(ci)破）。

6、 顯(xian)色(se)：每(mei)孔加入(ru)底(di)物液(ye)A液(ye)50µl再加B液(ye)50µl，輕(qing)輕(qing)振蕩混勻(yun)，25℃環(huan)境(jing)避(bi)光(guang)顯(xian)色(se)15min。

7、 測定：每(mei)孔加入(ru)終(zhong)止液(ye)50µl，輕(qing)輕(qing)振蕩混勻(yun)，設定酶標(biao)儀於450nm處（建議用(yong)雙波(bo)長450/630nm檢(jian)測在5min內讀完(wan)數(shu)據(ju)），測定吸光(guang)度(du)值(zhi)（OD值(zhi)）。

【結果判定】   

結(jie)果(guo)判(pan)定有兩(liang)種方法，粗略(lve)判(pan)定可用(yong)第1種方法，定量判(pan)定用(yong)第2種方法。註(zhu)意樣本(ben)吸光(guang)值(zhi)與諾(nuo)氟沙(sha)星的(de)含量成(cheng)負相關。

1、粗略(lve)判(pan)定

用(yong)樣本(ben)的(de)平(ping)均(jun)吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)與標準(zhun)品(pin)比較即(ji)可得(de)出(chu)其(qi)濃度(du)範圍(ng/ml)。假(jia)設樣(yang)本(ben)1的(de)吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)為0.238， 樣(yang)本(ben)2的(de)吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)為0.946，標(biao)準(zhun)液(ye)吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)分別(bie)是(shi)：0ppb為(wei)1.845； 0.1ppb為(wei)1.542；0.3ppb為(wei)1.130； 0.9ppb為(wei)0.635；2.7ppb為(wei)0.326； 8.1ppb為(wei)0.156。則(ze)樣(yang)本(ben)1的(de)濃度(du)範圍是(shi)2.7ppb-8.1ppb；樣(yang)本(ben)2的(de)濃度(du)範圍是(shi)0.3ppb-0.9ppb。乘(cheng)以(yi)其(qi)對應的(de)稀(xi)釋倍數(shu)即為樣(yang)本(ben)中(zhong)諾(nuo)氟沙(sha)星的(de)實際(ji)濃度(du)。

2、定量分(fen)析(xi)

（1）百(bai)分(fen)吸(xi)光(guang)率(lv)的(de)計(ji)算(suan)，標(biao)準(zhun)品(pin)或(huo)樣(yang)本(ben)的(de)百(bai)分吸光(guang)率(lv)等(deng)於標(biao)準(zhun)品(pin)或(huo)樣(yang)本(ben)的(de)百(bai)分吸光(guang)度(du)值(zhi)的(de)平(ping)均(jun)值(zhi)（雙孔）除(chu)以(yi)第壹(yi)個(ge)標(biao)準(zhun)（0標(biao)準(zhun)）的(de)吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)，再乘(cheng)以(yi)100%，即(ji)

B—標(biao)準(zhun)溶(rong)液(ye)或(huo)樣(yang)本(ben)溶液(ye)的(de)平(ping)均(jun)吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)

B₀—0ng/ml標(biao)準(zhun)溶(rong)液(ye)的(de)平(ping)均(jun)吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)

（2）標(biao)準(zhun)曲(qu)線的(de)繪(hui)制與計(ji)算(suan)

以(yi)標(biao)準(zhun)品(pin)百(bai)分(fen)吸光(guang)率(lv)為(wei)縱(zong)坐(zuo)標(biao)，以諾氟沙(sha)星標準(zhun)品(pin)濃度(du)（ng/ml）的(de)半(ban)對數為橫(heng)坐(zuo)標(biao)，繪(hui)制標準(zhun)曲(qu)線圖(tu)。將樣本(ben)的(de)百(bai)分(fen)吸(xi)光(guang)率(lv)代(dai)入(ru)標(biao)準(zhun)曲(qu)線中(zhong)，從標準(zhun)曲(qu)線上讀出(chu)樣(yang)本(ben)所對(dui)應的(de)濃度(du)，乘以其對應的(de)稀(xi)釋倍數(shu)即為樣(yang)本(ben)中(zhong)諾(nuo)氟沙(sha)星的(de)實際(ji)濃度(du)。

若(ruo)利(li)用(yong)試劑(ji)盒專業(ye)分析(xi)軟(ruan)件(jian)進(jin)行(xing)計(ji)算(suan)，更(geng)便(bian)於(yu)大(da)量樣(yang)本(ben)的(de)準(zhun)確(que)、快(kuai)速分(fen)析(xi)。（歡迎(ying)來(lai)電(dian)索(suo)取）

3、標(biao)準(zhun)準(zhun)曲(qu)線：

B/B0 (%)

         0.1                0.3                  0.9                 2.7              8.1

 (ppb) [µg/kg]

圖(tu)1：諾(nuo)氟沙(sha)星檢(jian)測試劑(ji)盒的(de)回歸曲(qu)線

4、再現(xian)性(xing)：

%CV 

            0       0.1     0.3     0.9     2.7    8.1

 (ppb) [µg/kg]

圖(tu)2：諾(nuo)氟沙(sha)星檢(jian)測試劑(ji)盒的(de)精(jing)密度

由(you)多個(ge)不(bu)同的(de)實驗結果(guo)確(que)定了精(jing)密度，圖(tu)2顯(xian)示出(chu)諾(nuo)氟沙(sha)星檢(jian)測試劑(ji)盒的(de)精(jing)密度情況(kuang)，獲(huo)得(de)的(de)標(biao)準(zhun)吸(xi)收(shou)值(zhi)的(de)變(bian)異系數（%CV）對(dui)相(xiang)應(ying)諾(nuo)氟沙(sha)星濃度(du)作曲(qu)線，可以看到在全(quan)部範圍內變異系數如(ru)此(ci)之低(di)，可以得(de)到很(hen)好(hao)的(de)再現(xian)性(xing)。

【註意事項(xiang)】   

6、 使(shi)用(yong)前(qian)將所有(you)試劑(ji)溫度回升至室(shi)溫20-25℃。試(shi)劑(ji)及標(biao)本(ben)沒(mei)有回到室(shi)溫（20-25℃）會導(dao)致(zhi)所(suo)有(you)標(biao)準(zhun)的(de)OD值(zhi)偏低(di)。

7、 在(zai)洗(xi)板(ban)過程中(zhong)如(ru)果出(chu)現(xian)板(ban)孔幹(gan)燥的(de)情(qing)況，則會伴(ban)隨(sui)著出(chu)現(xian)標(biao)準(zhun)曲(qu)線不(bu)成(cheng)線性，重(zhong)復性(xing)不(bu)好(hao)的(de)現(xian)象(xiang)。所(suo)以(yi)洗(xi)板拍(pai)幹(gan)後(hou)應(ying)立(li)即(ji)進(jin)行下(xia)壹(yi)步操(cao)作。

8、 混合(he)要(yao)均(jun)勻(yun)，否(fou)則(ze)會出(chu)現(xian)重(zhong)復(fu)性(xing)不(bu)好(hao)的(de)現(xian)象(xiang)。

9、 反(fan)應(ying)終(zhong)止液(ye)為2M硫(liu)酸(suan)，避(bi)免接觸(chu)皮膚(fu)。

10、 不(bu)要(yao)使用(yong)過了(le)有(you)效(xiao)日(ri)期(qi)的(de)試(shi)劑盒，稀釋(shi)或(huo)攙(chan)雜使(shi)用(yong)會引起靈敏(min)度、OD值(zhi)的(de)變(bian)化(hua)。不(bu)要(yao)交(jiao)換使用(yong)不(bu)同批(pi)號(hao)的(de)盒中(zhong)試劑。

11、 不(bu)用(yong)的(de)微(wei)孔板(ban)放進(jin)自(zi)封袋(dai)密封；標準(zhun)物質(zhi)和無(wu)色(se)的(de)發(fa)色劑對光(guang)敏(min)感，因此(ci)要(yao)避(bi)免直(zhi)接暴(bao)露(lu)在(zai)光(guang)線下。

12、 顯(xian)色(se)液(ye)若有任何顏(yan)色表(biao)明(ming)變質(zhi)，應當棄之。0標(biao)準(zhun)的(de)吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)小於0.5個(ge)單(dan)位（A_450nm< 0.5 ）時(shi)，表(biao)示試劑(ji)可能變質(zhi)。

13、 該(gai)試(shi)劑(ji)盒最佳反(fan)應溫度為(wei)25℃，溫度過(guo)高(gao)或(huo)過(guo)低(di)將導致(zhi)檢(jian)測吸光(guang)度(du)值(zhi)和靈敏(min)度發(fa)生變化(hua)。

【儲(chu)存】

原(yuan)包裝應(ying)儲(chu)存於2～8℃保鮮(xian)冷藏，切(qie)勿(wu)冷凍。

【有(you)效(xiao)期(qi)】

有(you)效(xiao)期(qi)12個(ge)月;生產(chan)日(ri)期(qi)、有(you)效期(qi)、生產(chan)批(pi)號(hao)見外包裝。